肺癌中微小染色体维持蛋白Mcm7作用蛋白的筛选及生物学功能研究

微小染色体维持蛋白Mcm7是DNA复制执照系统的成员，在保证每个细胞周期的DNA复制一次且只有一次的过程中起着重要作用。本项目是基于我们应用酵母双杂交方法从肺癌细胞cDNA文库中筛选出来的新的Mcm7结合蛋白ILK。实验数据显示ILK与Mcm7直接作用，进入细胞核磷酸化Mcm7蛋白。为了进一步研究肺癌中Mcm7蛋白与ILK作用的意义，本项目拟在前期工作基础上，应用免疫共沉淀、GST pull down等证实ILK蛋白与Mcm7在细胞内相互作用，发现结合域；利用四环素调控系统、RNAi技术，细胞内、外激酶实验，染色质结合实验、构建结合域突变体等探讨ILK对mcm7蛋白的磷酸化作用，以及对Mcm7与染色质结合、细胞周期的影响。本研究能使我们弄清Mcm7在肺癌细胞中的生物学特性及复制执照系统与肺癌发生发展的关系，将为寻找肺癌的治疗靶点提供新的理论依据。

目前研究显示肿瘤中染色质DNA异常是由复制执照系统调节失常所致。微小染色体维持蛋白Mcm7是DNA复制执照系统的成员，在保证每个细胞周期的DNA复制一次且只有一次的过程中起着重要。Rb蛋白、p27Kipl、INT6等与MCM7结合影响其与染色质的结合状态，调控DNA复制。MCM7还有哪些结合蛋白呢？发挥什么样的作用？我们以MCM7为诱饵蛋白，应用酵母双杂交实验从肺支气管上皮细胞cDNA文库中筛选出来的新的结合蛋白--RACK1。应用免疫共沉淀、激光共聚焦实验证实RACK1蛋白与Mcm7在细胞核内直接作用。调控RACK1表达，我们发现RACK1促进肺癌细胞周期进展和细胞增殖。利用四环素调控系统、RNAi技术，细胞内、外激酶实验，表明RACK1进入细胞核后，参与对MCM7蛋白的丝氨酸、苏氨酸位点磷酸化。应用western blot，RT-PCR和免疫组织化学，以新鲜肺癌组织以及肺癌组织芯片为研究对象，我们发现RACK1和MCM7在肺癌组织表达升高，并且与肺癌的组织学分级、TNM分期、淋巴结转移和生存期相关。综上，我们提出并应用分子生物学方法加以证实“肺癌细胞中RACK1进入细胞核内磷酸化MCM7蛋白，影响MCM7作为复制执照蛋白的正常功能，致DNA复制再执照、异常复制”的工作假说。组织学研究也证实RACK1与MCM7相关，并与肺癌的增殖和转移，以及生存期密切相关。肺癌细胞中RACK1通过MMP2途径上调CD147表达，与MMP3无关。此外，组蛋白甲基化转移酶与MT1h相互作用影响肺癌细胞的增殖和运动。本研究有助于使我们进一步弄清MCM7在肺癌细胞中的生物学特性，以及复制执照系统在肺癌发生发展中作用，将为以DNA复制为靶点寻找肺癌的治疗方法提供新的线索和依据。