基于上转换荧光技术的快速定量免疫层析试纸的研制

Up-convening phosphors (NaYF4:Yb3+,Er3+) were synthesized by acile hydrothermal method using oleic acid as a stabilizing agent. The optical properties and excitation and emission spectra of the phosphors was determined. The phosphors were labeled with antigens or antibodies through surface modification and activation. The up-converting phosphor technology-based lateral-flow immunoassay strips with the sensitivity of pg level were prepared by optimizing the labeling conditions, spraying film dose, protective agent, buffer system and application of technical conditions. The specificity, reproducibility, sensitivity, stability and quality guarantee period of the strips were tested. The expected results of this study will provide new technology support and research application platform for high sensitivity, quantitative, rapid detection of food residues and have great social and economic significance.

本研究拟采用水热合成法，以油酸为稳定剂合成新型上转换发光材料NaYF4:Yb3+,Er3+，研究其光学性质，确定其激发光谱峰和发射光谱峰。通过表面修饰与活化实现对抗原或抗体的标记。通过研究该上转荧光纳米颗粒和抗体或者抗原的标记条件、喷膜剂量调整、保护剂和缓冲系统应用等技术条件，优化试纸制备的各项工艺条件，制备敏感度达到pg级的基于新型上转荧光纳米颗粒标记的免疫学快速检测试纸，并对试纸的特异性、重复性、敏感性、稳定性以及保质期进行测定。本研究预期成果将为高敏感度、定量的食品安全快速检测提供新的技术支撑和研究应用平台，社会和经济意义重大。

稀土掺杂上转换荧光纳米材料因其近红外区激发，可见光区发射的特殊发光性能，在生物标记方面具有独特优势, 可大幅度降低荧光背景。NaYF4：Yb，Er 是目前已知的发光效率最高的上转换荧光纳米材料之一，已在生命分析及生物成像分析领域展现出了广阔的应用前景。然而，由于现有NaYF4：Yb，Er 制备工艺多是在高温条件下于高沸点有机溶剂中反应制得，所得产品在水溶液中的分散性差，限制了其在生命分析中的广泛应用。本文采用聚丙烯酸(PAA)配体交换反应， 对表面包覆油酸基团的疏水NaYF4：Yb，Er 纳米粒子进行了有效的表面修饰。 表面修饰后，上转换荧光纳米粒子表面的PAA 具有众多游离羧基，使其在水溶液中具有良好的分散性。同时，由于羧基的存在，使得带有氨基的生物分子能够通过化学交联反应结合到纳米粒子表面。利用PAA 表面修饰后NaYF4：Yb，Er 上转换荧光纳米粒子和CL-McAb联接，将上转换荧光抗体喷涂在结合垫上，分别选择CL-OVA和SPA作为NC膜上的T线和C线印迹，制成了上转换荧光检测试纸。在980 nm 激光激发下测定T线的上转换荧光强度，即可实现靶标分子的高灵敏分析。同时，通过激光扫描共聚焦荧光显微镜对免疫复合体进行荧光成像分析，背景荧光信号低，成像质量高。实验结果表明，PAA修饰的NaYF4：Yb，Er 上转换荧光纳米粒子是一种理想的生物标记材料，有望在生物传感及生物成像分析领域获得广泛应用。对上转换荧光检测试纸的性能进行了鉴定，定量检测范围为10ng/mL-10pg/mL，LOD为10pg/mL，较同抗体制备的胶体金试纸灵敏许多，具有较好的特异性，与同系物几乎无交叉，具有良好的重复性、准确性，有效期至少为6个月。建立了检测猪尿样品中CL残留的GC-MS方法，其线性检测范围为 0.10-600ng/mL，LOD为0.1ng/mL。比较分析了GC-MS和上转换荧光试纸对实际样品的测定结果，上转换荧光检测试纸与确证方法GC-MS的符合率为100%，进一步确证了上转换荧光试纸检测CL残留具有较好的准确性、时效性。