基于荧光纳米颗粒标记的高敏感免疫学快速检测试纸研究

本研究拟采用新型稀土金属络合物，通过油包水型（W/O）反相微乳法制备均一的二氧化硅纳米颗粒，并将其以共价结合的方式标记在氨基化的空颗粒表面，以Eu3+等稀土金属离子致敏发光后，制得新型荧光纳米颗粒，该荧光纳米颗粒有时间分辨荧光性质，又具有了纳米颗粒的放大效应，使其荧光度得到了极大的增强。通过研究该荧光纳米颗粒和抗体或者抗原的标记标记条件、喷膜剂量调整、保护剂和缓冲系统应用等技术条件，优化试纸制备的各项工艺条件，制备敏感度达到pg级的基于新型稀土金属荧光纳米颗粒标记的免疫学快速检测试纸，并对试纸的特异性、重复性、稳定性以及保质期进行测定。本研究预期成果将为高敏感度的兽医免疫学快速诊断和食品安全检测提供新的技术支撑和研究应用平台，社会和经济意义重大。

采用反相微乳法制备了SiO2纳米颗粒，通过改变DDW的量得到了粒径在14~97nm之间的分散性较好、粒径均一的球形SiO2纳米颗粒。同时采用Stöber法制备了SiO2纳米颗粒，通过改变TEOS的量得到了粒径在93~398nm之间的单分散、粒径均一的球形SiO2纳米颗粒。用硅烷偶联剂APTS对制备的SiO2纳米颗粒进行表面修饰，傅里叶红外光谱仪证明改性成功。选择具有优良发光性能的稀土配合物BHHCT-Eu3+为荧光材料，制备了共价型稀土荧光纳米颗粒。利用氧化后Dextran-500k的醛基成功的将带氨基的稀土荧光纳米颗粒和CL-McAb联接，将稀土荧光抗体喷涂在结合垫上，分别选择CL-BSA和SPA作为NC膜上的T线和C线印迹，制成了稀土荧光检测试纸。对稀土荧光检测试纸的性能进行了鉴定，其肉眼观测完全抑制限为1.6ng/mL，定量检测范围为0.04~1.27ng/mL，LOD为0.04ng/mL，较同抗体制备的胶体金试纸灵敏许多，具有较好的特异性，与同系物几乎无交叉，具有良好的重复性、准确性，有效期至少为6个月。选择具有优良发光性能的FITC为荧光材料，制备了掺杂型的 FITC-SiO2纳米颗粒。利用氧化后Dextran-500k的醛基将带氨基的FITC-SiO2纳米颗粒和CL-McAb联接，将FITC荧光抗体喷涂在结合垫上，分别选择CL-BSA和SPA作为NC膜上的T线和C线印迹，从而制成了FITC荧光检测试纸。对FITC荧光检测试纸的性能进行了鉴定，其肉眼观测完全抑制限为6ng/mL，定量检测范围为0.16~5.18ng/mL，LOD为0.16ng/mL，较同抗体制备的胶体金试纸灵敏，具有较好的特异性，与同系物几乎无交叉，具有良好的重复性、准确性，有效期至少为6个月。建立了检测猪尿样品中CL残留的GC-MS方法，其线性检测范围为 0.10~500ng/mL，LOD为0.1ng/mL。比较分析了GC-MS、稀土荧光试纸和FITC荧光试纸对实际样品的测定结果，稀土荧光检测试纸与确证方法GC-MS的符合率为100%，FITC荧光检测试纸与确证方法GC-MS的符合率为97.6%，进一步确证了稀土荧光试纸和FITC荧光试纸检测CL残留具有较好的准确性、时效性。