Pitx2在牙源上皮向成釉细胞分化中的表观调控机制

Pitx2 functions as an important transcription factor in dental enamel development, and mutations of PITX2 cause Axenfeld-Rieger syndrome with hereditary amelogenesis imperfecta. In this project, we focus on the epigenetic regulatory mechanism of Pitx2 in the gene control of important dental epithelial transcription factors. Our work model hypothesizes that: Pitx2 recruits histone modification enzymes MLL and JMJD3, together with the release of chromatin-remodeling factor HMG17 via Wnt/-catenin signaling, contributes to transcriptional activation of target genes Dlx2, Dlx3, and FoxJ1, initiating the differentiation process of dental epithelial cells into ameloblasts. To clarify these epigenetic regulatory relationships, we utilize in vivo mouse incisor model and in vitro ameloblast lineage, to carry out series of cellular and molecular experiments such as in situ hybridization, luciferase assays, ChIP-re-ChIP and Co-IP. The study would focus on three key issues: 1. Expression pattern of epigenetic factors MLL, JMJD3, and HMG17 in dental epithelium tissue; 2. Regulation function and binding sites of Pitx2 on the target genes Dlx2, Dlx3, and FoxJ1; 3. Interaction between Pitx2 and MLL, JMJD3, HMG17, and their synergetic effects on expression of target genes. The potential results will be crucial in understanding the fundamental mechanisms of tooth development and amelogenesis defects, and will provide new clues to dental regeneration.

Pitx2是遗传性牙釉质发育缺陷致病基因。本研究旨在了解Pitx2，在牙源上皮向成釉细胞分化过程中，对牙上皮分化相关基因的调控作用，着重探讨这一过程中的表观遗传调控机制。通过系统文献复习及课题组前期工作，提出工作假设：Pitx2结合组蛋白甲基化修饰酶MLL和JMJD3改变靶基因的组蛋白甲基化修饰状态，经Wnt/β-catenin信号释放表观重塑蛋白HMG17易化染色质结构状态，两者协同激活Dlx2、Dlx3和FoxJ1表达，是启动牙源上皮向成釉细胞分化的关键机制。研究采用小鼠切牙模型和体外成釉细胞系，利用原位杂交、Co-IP等技术，希望重点明确上述假说中的三个关键问题：1. 表观修饰因子MLL、JMJD3、HMG17在切牙上皮分化不同阶段的表达特征，2. Pitx2对下游靶基因的调控及准确的作用位点，3. Pitx2和MLL、JMJD3、HMG17在靶基因调控区的结合方式及对基因表达影响。

项目以Pitx2与表观修饰因子的相互作用关系为切入点，探究表观蛋白在牙源上皮干细胞增殖和分化起始中的必要性和重要性。项目实施中，重点研究了Pitx2相关的表观修饰酶KMT2D在牙上皮发育中的表达特征及作用机制。研究结果显示：（1）免疫荧光结果表明，KMT2D和H3K4me1在蕾状期和帽状期小鼠磨牙胚成釉器中呈现强表达信号，与细胞快速增殖标志物Ki67具有表达一致性。（2）KMT2D表达稳定敲低后，牙上皮细胞（LS8）增殖速率下降，细胞周期呈现G1期阻滞现象，同时，细胞核中H3K4me1和H3K4me3修饰水平显著下调。（3）RNA二代测序并进行GO联合KEGG分析发现，KMT2D敲低影响细胞增殖功能，并显著干扰Wnt信号通路相关基因表达。Realtime PCR和Western blot证实，KMT2D敲低后，Wnt信号通路分子包括Lgr4, Lef1, β-catenin以及Bmi1表达显著性降低。（4）细胞免疫荧光发现，KMT2D敲低干扰β-catenin入核，而Wnt激动剂LiCl刺激可部分逆转KMT2D对β-catenin入核的干扰作用。同时，LiCl刺激后，部分逆转KMT2D敲低引起的细胞增殖效率的降低和细胞周期阻滞现象，并部分逆转KMT2D敲低导致的Wnt相关基因表达改变。这些结果表明，KMT2D通过调节Wnt/β-catenin信号通路，在牙齿上皮细胞增殖和细胞周期稳态中发挥关键作用。总结：本项目详细研究了表观蛋白KMT2D在牙上皮发育中的表达特征和调控机制，为探究牙上皮发育的精细表观机制提供新的依据，并为揭示牙齿缺陷疾病KS的致病机理提供线索。课题按计划完成。培养硕士研究生和博士研究生各一名,参与青年研究者二名，为后续研究打下了坚实的基础。截至目前，有关结果已经整理成英文科学论文2篇，计划后续撰写中文论文2篇。英文论文其中1篇投稿peer J杂志，目前正在根据杂志审稿专家意见做小的修改，有望近期发表。另外1篇投稿cell proliferation杂志正在审稿中。