ETV1/5在ES-ECs成釉细胞向分化中的调控机制研究

The demand for bioengineered teeth or hard dental tissue, including enamel and dentin is increasing as tooth loss and dental defects constitute a prevalent health issue in dentistry. The key to tooth regeneration is reconstitution of the signaling in tooth development and availability of tooth forming cells. Dental enamel cannot regenerate itself since enamel forming ameloblasts commit apoptosis once tooth eruption. Lacking of human dental epithelial stem cells in adult body constrains the progressing of cell based enamel regeneration. Human embryonic stem cells (hESCs), pluripotent cells that are capable of differentiating into any cell types in human body,hold great promise to regeneration medicine and could be an ideal source of ameloblast regeneration. Our previous studies indicated that the hESC-derived epithelial cells (ES-ECs) have the potential to differentiate into ameloblast-lineage cells by secreting enamel forming extracellur matrix under odontogenic inductive signaling of human fetal dental mesenchymal cells. Microarray data showed the expression level of transcription factor Etv1 and Etv5 between non-dental oral epithelial cells and different stages of ameloblast-lineage cells are significantly different. In this present study, we aim to establish the amelogenesis-associated key gene expression profile, and investigate the role of Etv1 and Etv5 in regulating ameloblastic differentiation of ES-ECs and the underling potential mechanisms; Besides, we aim to utilize the odontogenic inductive ability of human fetal dental mesenchyme to engineer the gene modified ES-ECs into further ameloblastic differentiation and proceed futher histogenesis and morphogenesis. By carrying out this present study, we aim to improve our previous enamel-forming cells regeneration system and the signaling between epithlium and mesenchyme.

牙发育完成后成釉细胞程序性凋亡，成体内没有牙源性上皮干细胞用于釉质再生。人胚胎干细胞是具有多向分化能力的多能性干细胞，是釉质再生可能的种子细胞来源。本课题组前期研究发现人胚胎干细胞来源的上皮细胞（ES-ECs）在人胚牙间充质细胞的成牙诱导信号作用下表达釉原蛋白并形成蕾状上皮样结构，具有一定的成釉细胞向分化潜能；基因芯片结果显示转录因子Etv1和Etv5的基因表达水平在分泌期成釉细胞内显著性降低。本课题拟根据前期基因芯片结果采用相关分子生物学手段，构建人牙胚发育过程中成釉关键基因的表达谱；并研究慢病毒介导的转录因子Etv1/5基因表达水平改变对ES-ECs的成釉细胞向分化的调节作用及其机制；进一步利用人胚牙间充质细胞的成牙诱导信号，通过体外三维共培养/体内肾囊膜下移植手段，探索基于基因修饰的ES-ECs的成釉细胞再生系统。通过本项目研究完善成釉细胞再生体系及上皮-间充质信号对话系统。

牙发育障碍及后天缺损严重影响了患者的咀嚼功能与生活质量，是危害人类健康的最重要的口腔问题之一。因此，牙发育及再生一直是口腔医学研究领域的前沿与热点，其关键问题在于牙发育分子信号机制的研究及牙再生种子细胞的选择与模型的建立。牙釉质是覆盖在牙齿表面的一层精细排列的矿化组织，对于牙齿发挥咀嚼功能起到了重要作用。牙发育完成后，成釉细胞进入程序性凋亡，因而成体内没有牙源性上皮干细胞可作为牙釉质再生的种子细胞。..人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells, hESCs)是具有多向分化能力的多能性干细胞，在再生医学研究中具有广泛的应用前景。本课题组前期对hESCs的成釉细胞向分化进行了系列研究：通过化学诱导的方式使hESCs进行上皮细胞向分化成为人胚胎干细胞来源的上皮细胞（hESC-derived epithelial cells，ES-ECs），表达上皮细胞特异性细胞角蛋白及成牙相关基因；利用人胚牙间充质细胞的成牙诱导能力，使ES-ECs在体外三维共培养及体内肾囊膜下移植条件下进行成牙上皮向的分化，表达釉原蛋白并形成蕾状上皮样结构，初步构建了基于体外细胞培养技术的成釉细胞再生模型。本课题根据基因芯片数据进行荧光定量PCR验证证实，分泌期成釉细胞中Etv1和Etv5表达水平显著下降，提示Etv1和Etv5在成釉细胞分化过程中的调控作用。使用KEGG通路分析，将差异性表达基因进行通路相关的分类富集，从而分析得出最具有差异性的相关通路。为了进一步深入分析转录基因之间的相互关系及其对成釉细胞分化的影响机制网络，对所有差异性表达的基因在KEGG通路中进行了基因调控网络的构建，共获得7个成釉相关调控网络。采用基因本体分析(GO analysis)对差异性表达的基因在成釉细胞分化过程中的作用进行分类。基因共表达网络提供了一个良好的功能预测方式。这些假说性的基因在基因共表达网络当中与其功能相关基因具有良好的共表达状态。在实际课题进展过程中，发现不同发育时期牙间充质对口腔上皮细胞具有不同的诱导分化作用，发现发育期牙乳头细胞可以诱导口腔上皮细胞进行成牙向命运选择，成人牙髓细胞进行BMP7/EREG处理后可以诱导口腔非牙源性上皮细胞表达釉原蛋白基因（Amelogenin），釉蛋白（Amelotin）与成釉蛋白（Ameloblastin）。