山黧豆毒素合成与半胱氨酸合成酶家族关系的研究

山黧豆是一种抗旱性极强、种植历史悠久的豆类作物。由于其氨基酸性质的毒素存在和半胱氨酸来源的有机硫营养水平很低，长期食用易使人畜中毒从而限制了在干旱半干旱地区的种植。早期认为毒素合成的中间物由半胱氨酸合成酶家族成员以乙酰丝氨酸为底物催化形成。我们前期研究和植物半胱氨酸合成酶家族特点表明，这一中间物实际上由该家族酶的另外成员直接以半胱氨酸为底物催化形成。为了研究这种酶，我们建立了该酶的活性检测方法，想进一步利用该家族酶特征对它进行纯化并研究其酶学性质，同时利用该家族成员序列的保守性克隆该酶的基因，然后对该基因进行同源性分析并克隆进入适宜载体进行异源表达分析,便以进一步确认该酶的性质。最后通过RNA干扰技术降低它的表达来分析毒素、毒素中间物及半胱氨酸相关代谢物的含量变化情况。因此，通过全面研究毒素中间物合成酶，将为降低毒素水平、同时提高有机硫营养的育种工作提供一种新的有效途径。

山黧豆硫代谢的入口酶——半胱氨酸合成酶(CSase)也是其毒素——β-N-草酰-L-α,β-二氨基丙酸（β-ODAP）代谢前体β-(异噁唑-5-酮-2-基)-丙氨酸（BIA）的合成酶。本项目以此为基础，重点研究了CSase分离纯化及酶学基本特征，克隆了CSase家族的系列同工酶基因。主要研究成果如下：. 1、山黧豆中至少存在4种CSase酶，可分别暂命名为CSaseⅠ，CSaseⅡ，CSaseⅢ和CSaseⅣ。CSaseⅠ主要在叶与根中表达，CSaseⅡ和CSaseⅢ主要在叶中表达，成熟种子只表达CSaseⅢ。CSaseⅠ在山黧豆中主要起到CASase的作用。. 2、山黧豆CASase是合成其毒素β-ODAP前体——BIA的主要酶。在山黧豆营养生长时期，CASase主要功能为解氰毒；而在种子成熟与种子萌发时，主要功能为合成BIA，进而积累β-ODAP。. 3、CSase与CASase的催化动力学研究表明：合成半胱氨酸时，最适反应时间为10min。两类酶最适pH均为8.0，底物O-乙酰-丝氨酸和Na2S最适浓度分别是10 mmol•L-1和5 mmol•L-1。合成β-CAS时，两类酶最适反应时间为30min，CSase和CASase酶的最适pH均在9~10范围内，底物Cys最适浓度均为3 mmol•L-1，而底物KCN最适浓度前者为80 mmol•L-1，后者为3 mmol•L-1。. 4、同源比较法对山黧豆CSase同功酶编码序列进行克隆，获得其保守的片段序列3个，进而首次在山黧豆中获得4个Csase同功酶基因编码全长序列。. 5、对克隆到的两个山黧豆CSase基因，即GPOAS-TL-2及GPOAS-TL-3构建RNAi植物表达载体，并将其转化至拟南芥野生型(Col-0)中。结果表明：转基因植物中OAS-TL的表达量下降，说明内源OAS-TL基因表达由于RNAi作用被抑制。. 研究结果证实了CASase是合成BIA，进而合成山黧豆毒素的主要酶类。同时发现山黧豆中半胱氨酸不能积累的主要原因是被CASase用来解除氰毒。整个项目成果对理解山黧豆硫含量低的原因提供了重要证据，项目达到了预期研究目标。