基于酶催化的氰化物污染现场快速检测研究

Simple inorganic cyanides are high toxicity, they, however, are widely used in organic fiber synthesis, electroplating, mining, and many other industries. The cyanides leakage or the excessive emissions with wastewater often occur. Therefore, the rapid, accurate, sensitive and specific field detection technology for cyanide is urgently required in cyanide pollution accidents. The detection methods available at present are not suitable for field measurement because of characteristics and defects of the methods. The enzymes have been widely used in the detection of pollutants owing to the rapid and specific catalytic activity. In the study of plant cysteine synthase family members we cloned and successfully prokaryotic expressed the gene of β-cyanoalanine synthase (β-CAS), which can specific conversion of cyanide. The catalytic reaction thereafter was the first time used to detect the concentration of cyanide. In order to meet the requirements of rapid field detection, this project will be conducted to further optimize the process conditions by using a range of techniques from biochemistry, molecular biology and enzyme engineering. These optimizations include highly efficient preparation of enzyme product, sample pretreatment, composition of catalytic reaction medium and the enzyme immobilization. The research results will provide a technical basis for development of field cyanide assay, which should be simple, rapid, specific and sensitive.

简单无机氰化物是剧毒物质，但仍广泛应用于有机纤维合成、电镀、采矿等许多行业，随废水超标排放或泄漏时有发生。氰化物污染事故的发生迫切需要现场快速、准确、灵敏、特异的氰化物检测技术。国内外目前采用的检测手段由于技术本身的特点和缺陷不适合现场操作。生物酶由于快速、特异的催化活性，已广泛应用于污染物的检测。本课题组研究植物半胱氨酸合成酶家族成员时，克隆并成功原核表达了一种特异性转化氰化物的酶——β-氰基丙氨酸合成酶（β-CAS）基因，并首次应用β-CAS酶的催化反应来检测氰化物浓度。为满足现场快速检测要求，本项目将利用生物化学、分子生物学及酶工程等系列技术进一步高效制备β-CAS酶制剂，研究适合现场快速检测氰化物的样品前处理技术、酶反应介质和酶固定形式。项目研究将为简便快捷、特异灵敏的现场氰化物检测手段提供技术基础。

简单无机氰化物（Cyanide）（CN－）的实验室检测手段多样，技术成熟，但对于环境污染及泄漏的现场快速检测尚未建立有效的技术手段。本项目依据植物β-氰基丙氨酸合成酶（β-cyanoalanine synthase，β-CAS）能特异性的催化氰根离子（CN－）与半胱氨酸反应产生H2S的特性，通过研究建立了可靠的一套氰化物现场快速检测技术。圆满完成了项目设定的目标任务。研究主要内容、成果及意义如下：. 1．通过突变、克隆筛选得到了酶活力高、稳定性好的β-CAS酶基因，酶蛋白单体分子量约44KDa，简称CAS-44，该基因转化大肠杆菌产生了稳定表达CAS-44的工程菌株。为工业规模化生产该酶建立了优良菌种。 . 2．建立了快速、简单、低成本原核表达CAS-44的一步纯化技术。除了可以采用组氨酸标签通过镍柱纯化外，课题组还开发出了更简单、更便宜的规模化快速纯化技术。为获得高质量工业化酶制剂生产提供了可靠的技术参考。. 3．通过尝试各种酶固定化技术，本项目建立了CAS-44酶的琼脂糖珠固定化技术。采用此技术，不但能使CAS-44酶与琼脂糖微粒牢固结合，而且其酶活性及稳定性不会受影响，得到了性能优良的酶制剂——CAS-44A，既便于酶的储存与运输，也便于检测操作。为工业规模化产生活性强、性能稳定的检测酶制剂提供了初步的产品模型。. 4．通过优化酶促反应条件，筛选到合适的反应介质以及反应促进剂，建立了室温下快速完成CAS-44A催化反应的操作技术。使检测反应时间最终缩短至2－5min。从而为现场快速操作奠定了基础和技术优势。. 5．现场样品成分复杂。为了消除检测时的离子干扰，课题组对样品前处理进行了详细研究，最终建立以消除干扰并浓缩样品为基础的样品前处理技术。. 6．课题组已经建立了所有快速检测技术流程，集成为一整套技术，现积极准备技术发明专利申请及论文发表，希望能加快该技术的推广应用。