参与NtMYC2介导的烟草尼古丁生物合成负调控因子的鉴定

Nicotine is the predominant alkaloid in tobacco (Nicotiana tobacum) and determines smoke quality and causing addiction to smoking. Nicotine biosynthesis is regulated by jasmonic acid (JA) signaling transduction pathway. MYC2, as a functional conserved factor, regulates downstream gene expressions directly or indirectly. Previously, our results demonstrated that CrMYC2 interacts with transcriptional repressor CrGBF to antagonic inhibit terpenoid indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus. Similarly, we also found that overexpression of NtMYC2 also triggered the antagonic inhibition on nicotine biosynthesis gene expression in tobacco. In this proposal, we will conduct transcriptomic analysis on NtMYC2 overexpression and RNAi transgenic lines and orthological comparison of other transcriptional repressor sequence to investigate candidate transcription factor function as a the NtMYC2-midaited negative regulator in nicotine biosynthesis. Phylogenetic analysis, subcellular localization, DNA-protein (or protein-protein) interaction assay, nicotine biosynthetic gene expression levels and nicotine contents in transgenic overexpression and knock down plants will be analyzed to verify the inhibition function of candidate regulator. The results will not only further our understanding of the inhibitory regulation of nicotine biosynthesis, but also provide gene resource which can be used in tobacco breeding program.

尼古丁是烟草中最主要的生物碱，其含量直接决定烟气质量和吸烟成瘾性。尼古丁的生物合成主要受茉莉酸（JA）信号转导途径调控。MYC2作为JA转录调控系统中功能保守的调控元件直接或间接调控下游基因表达。项目组前期证明在长春花中CrMYC2通过与转录抑制因子CrGBF互作实现对萜类吲哚生物碱合成的拮抗调控；同时发现在烟草中过表达NtMYC2也可激发烟草体内抑制机制来降低尼古丁合成基因表达。本项目拟以NtMYC2过表达和沉默表达转基因烟草为实验材料，利用转录组分析和同源JA响应抑制因子序列比对的方法，研究参与NtMYC2介导的尼古丁合成负调控因子。对筛选到的转录因子进行进化分析、细胞亚定位、DNA-蛋白（或蛋白-蛋白）互作实验，并测定转基因植株中尼古丁合成基因表达量以及尼古丁含量，验证其如何与NtMYC2作用来抑制尼古丁合成。本研究结果可为利用生物技术手段改变烟草中尼古丁含量提供基因资源和理论依据。

NtMYC2作为JA信号途径中重要的调控因子，其在JA所诱导的转录水平重塑过程中发挥诸多作用。本项目以NtMYC2转录组数据为基础，筛选可拮抗抑制NtMYC2转录活性的尼古丁合成负调控因子并对其拮抗抑制机理进行阐明。同时对受NtMYC2调控的下游乙烯响应因子（ERF）转录因子基因调控尼古丁生物合成机理进行了研究。主要研究结果如下：.1）烟草尼古丁正向合成是由转录激活因子来实现的，如NtMYC2，NIC2位点ERF基因。然而，对于尼古丁反馈抑制调控机理仍不明确。本研究中，我们证明在烟草中过表达NtARF6可以显著降低烟草生物碱在烟株叶片中的积累。利用转录组学发现NtARF6转录因子不通过直接结合尼古丁生物合成关键酶基因启动子区域来降低其转录活性，而是通过拮抗茉莉酸途径的乙烯、水杨酸、脱落酸以及病菌侵染防御途径来间接降低尼古丁生物合成基因表达。.2）烟草ERF91基因正向调控烟草生物碱积累。NtERF91在根中特异表达且受JA诱导。体外实验证明NtERF91能够直接结合GCC-box元件与NtPMT2和NtQPT2启动子结合并转录激活NtQPT2基因表达。过表达烟草NtERF91不仅能提高尼古丁生物合成基因表达，还能改变生物碱积累模式，导致新烟碱大量累积。NtERF91在烟草生物碱积累过程中发挥着功能冗余且独特的的调控作用。.3）烟草尼古丁合成受两个独立的NIC位点（NIC1和NIC2）调控。本研究发现在烟草基因组7号染色体上有一个与NIC2位点类似的ERF同源基因簇，并证明此ERF基因簇为“NIC1位点”且位于NtMYC2调控下游。此外，这些基因在烟草根部特异表达并在JA诱导后与尼古丁合成基因、调控因子基因表达趋势一致。蛋白-DNA互作、转录激活、转基因实验表明这些ERF基因能不同程度地激活NtPMT2和NtQPT2基因表达，实现量化调控烟草生物碱的积累。