乙烯响应因子NtERFS1调控烟草去甲基尼古丁合成的机理研究

Nornicotine is one of the main alkaloids of genus Nicotiana, which can serve as the precursor of carcinogen N-nitrosonornicotine (NNN) synthesis. The NtCYP82E4, encoding the most effective nicotine demethylase for nornicotine formation, has been cloned, however, the regulatory mechanism of this genes is not clear yet. Previously, we identified an ERF transcription factor gene, NtERFS1 via yeast one-hybrid screening of tobacco leaf cDNA library using the fragment of NtCYP82E4 promoter as the bait. Our data shows that NtERFS1 was strongly induced in tobacco leaf by exogenous application of Ethylene and full-length NtERFS1 was confirmed to bind to the promoter of NtCYP82E4 in yeast one-hybrid assay. Both results imply that this gene functions in regulating nornicotine formation. In this project, we will further confirm the binding of NtERFS1 to the NtCYP82E4 promoter via EMSA and ChIP assays, characterize its function by transgenic analysis. Also, we will investigate the sub-cellular location of NtERFS1 and its transactivation on NtCYP82E4. In addition, we will test whether Ethylene regulating nornicotine formation is NtERFS1 dependent through NtERFS1 knockout lines. The data we collect from this research will help to better understand the regulatory mechanism involved in nornicotine formation.

去甲基尼古丁是烟草属主要生物碱之一，它是致癌物质NNN形成的前体物质。去甲基尼古丁合成关键基因NtCYP82E4已被克隆并进行功能鉴定，但合成调控机制尚无深入研究。前期利用NtCYP82E4启动子片段构建诱饵载体，通过酵母单杂交筛选获得一个候选转录因子NtERFS1。初步研究表明其表达受到乙烯的强烈诱导，在酵母细胞内能与NtCYP82E4启动子片段互作。本项目拟进一步验证NtERFS1是否能够调控NtCYP82E4基因表达，开展亚细胞定位及转录激活分析；通过EMSA及ChIP验证体外及体内DNA-蛋白互作；分析NtERFS1基因过表达及敲除植株中相关基因表达及去甲基尼古丁含量。同时利用乙烯处理NtERFS1基因敲除株系，研究该基因在乙烯调控去甲尼古丁合成中是否必要。本研究结果将可能阐明乙烯调控去甲基尼古丁合成的分子机制，为生物技术手段降低烟草中去甲基尼古丁含量提供基因资源及理论依据。

烟草中尼古丁在尼古丁去甲基酶（NtCYP82E4）催化下形成去甲基尼古丁，后者在烟叶烘烤、贮存过程形成致癌物NNN。因此，解析NtCYP82E4基因的调控机制，抑制其表达是降低烟草NNN含量的重要目标。本项目以NtCYP82E4基因启动子为诱饵序列，通过酵母单杂交筛选到一个ERF类转录因子NtERF173。NtERF173在不同生长时期的烟草叶片及成熟期烟株的根、茎、叶、花组织中均有表达，表明该基因可能具有组成型功能，参与植物生长发育。NtERF173编码蛋白定位于细胞核，EMSA和酵母激活试验表明其在体外和酵母中能够结合NtCYP82E4基因启动子，转录激活试验表明NtERF173能够激活NtCYP82E4基因启动子表达。NtERF173基因过表达植株中包含去甲基尼古丁在内的所有生物碱含量都显著提升，但包括NtCYP82E4在内的所有生物碱代谢相关基因的表达水平均无变化，这表明NtERF173通过一个未知机制促进烟草生物碱合成。. 在EMS突变体库中筛选到NtERF173及其同源基因NtERF173TY发生无义突变的材料，通过进一步杂交筛选获得上述基因单突和双突材料，结果表明NtERF173和NtERF173TY基因突变能够降低烟叶生物碱水平，严重影响根组织发育。信息学分析表明NtERF173与拟南芥WIND1序列一致性超过40%，而WIND1参与植物芽、愈伤组织的再生过程，结合NtERF173基因RNAi植株无法生根的表型，我们推测NtERF173参与烟草根组织生长发育调控。由于EMS突变体材料基因组存在大量未知突变，我们利用基因组编辑技术获得了上述基因的突变体材料将进行后续功能验证。由于生物碱在烟草根中合成，我们推测NtERF173可能在调控根组织生长发育的基础上影响生物碱合成，这将在直接上调生物碱合成基因表达水平提高生物碱含量操作之外，提供一个新的提高烟叶生物碱含量的策略。