杨树中参与半纤维素生物合成的转录调控因子鉴定与功能研究

纤维素乙醇作为一种清洁的可再生能源已经受到世界上许多国家的关注和重视，然而半纤维素的有效利用一直是困扰纤维素乙醇生产领域的瓶颈问题之一，部分原因在于缺乏对生物质本身的了解。故阐明生物质的生物合成及其调控机制是解决生物质利用困难的关键问题之一。本研究项目将以我们曾经功能鉴定的四个直接参与杨树半纤维素生物合成基因为基础，通过克隆和功能研究它们的启动子，利用酵母单杂交系统克隆它们各自的转录调控因子，并在能源植物杨树中进行过表达和RNAi敲除实验，检测其对植株生长与发育以及终产物半纤维素的生物合成的影响。本研究的开展以期探明在半纤维素生物合成调控途径中各转录因子所起的调控作用，进一步揭示半纤维素生物合成的调控机制，有助于解析如何提高半纤维素的产量和定向改良其生物质特性以便获得高效且易于转化的生物质。故本课题的提出是能源植物杨树分子改良工程发展的需要，是一项在理论与应用上具有重要的探索意义。

以非粮纤维生物质生产燃料乙醇已在世界范围内引起广泛关注，半纤维素的有效利用一直是困扰燃料乙醇产业发展的主要技术瓶颈之一，部分原因在于对半纤维素生物合成以及调控的认识不足，因此阐明半纤维素的生物合成及其调控机制，将有助于其转化利用困难的关键技术瓶颈。半纤维素的合成调控主要发生在转录水平，而转录因子起着关键调控作用。本项目首先筛选与半纤维素合成相关的关键转录因子基因。通过生物信息学手段并结合全基因组芯片分析，筛选到参与杨树半纤维素合成的相关NAC、HD-ZIP、WRKY以及CCCH转录因子32个，并通过实时荧光定量PCR和原位杂交技术对其表达模式进行了验证。为研究这些转录因子在半纤维素合成调控中的作用，对部分关键转录因子分别转化拟南芥和杨树进行了功能分析，结果表明其过量表达影响了植株地上部生物量以及纤维生物质的组分及结构。此外对其下游调控的两个可能的靶基因进行了详细的功能分析，这两个基因（PdCSLD5和PdCSLD6）均属于纤维素合酶类似基因，二者过表达均可以互补拟南芥csld3突变体的表型，突变体的根毛密度恢复到与野生型一致。而且过表达PdCSLD5和PdCSLD6基因可以促进根系发育，过表达植株的根长和根毛密度显著增加，而且过表达转基因株系地上部的生物量显著增加。对突变体、野生型和过表达植株根部进行多糖酶联免疫分析（ELISA），发现在突变体和过表达植株中半纤维素组分发生显著性变化，表明PdCSLD5和PdCSLD6可能参与木葡聚糖的合成。用CBM3a和CBM17抗体分别进行免疫分析发现，与野生型相比，突变体植株的根中结晶化纤维素含量减少，而过表达株系根中结晶化纤维素显著增加，根据以上结果推测杨树PdCSLD5和PdCSLD6基因可能参与根部木葡聚糖与纤维素的相互作用，进而影响纤维素的结晶化。该研究结果将有助于深入揭示半纤维素的生物合成及其调控机制，为进一步提高半纤维素的产量和定向改良其生物质特性以便获得高效且易于转化的生物质提供理论依据。