结核分枝杆菌胞外鞘磷脂酶Rv0888诱导肺脏中性粒细胞胞外诱捕网形成继而促进炎症反应的机制研究

Tuberculosis (TB) is an important infectious disease and severely threatens human health which caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), and characterized with the pathological lesions of lung granuloma, fibrosis and necrosis. Therefore, it is important to elucidate the pathogenic mechanism of Mtb for the development of new vaccines and drugs. Previous studies have shown that sphingomyelinase Rv0888 could not only induce obvious inflammatory reaction, pathological damage and netrophil extracellular traps (NETs) formation in lung of mice, but also there is a close connection between the formation of NETs and the severity of lesions. It is supposed that NETs mediate the inflammatory response and pathological lesions of lung in mice, but the mechanism is unknown. Our project will take Mtb Rv0888 protein as the research target and focus on the formation of NETs which mediates the inflammatory response and pathological lesions in the lung. The aims of project are to decipher the mechanism of NETs formation induced by Rv0888, analyze the signal pathways of lung inflammatory response and pathological lesions mediated by NETs in mice, confirm the inhibitors which reduce the inflammation and pathological damage in mice and elucidate the function of Rv0888 inducing NETs and inflammation of lung in mice, which could enrich the understanding of the pathogenesis of Mtb as well as provide foundation for the development of new vaccines and drugs against TB.

结核病是由结核分枝杆菌（Mtb）引起的严重危害人类健康的一种重要传染病，以肺脏肉芽肿、纤维化和坏死等病变为特征，阐明Mtb的致病机制对于研发新型疫苗和药物均具有重要意义。前期研究表明，MtbRv0888的鞘磷脂酶活性不仅诱导小鼠肺脏产生明显的炎症反应、病理变化和中性粒细胞胞外诱捕网（NETs），而且NETs的形成与病变严重程度密切相关，推测NETs介导了小鼠肺脏的炎症反应和病理变化，但其机制不清。本项目以MtbRv0888蛋白为研究对象，以小鼠肺脏形成的NETs及其介导的炎症反应和病理变化为主线，研究Rv0888诱导NETs的形成机制，解析NETs介导小鼠肺脏炎症反应和病理损伤的信号通路，筛选消减小鼠炎症反应和病理损伤的抑制剂，阐明Rv0888诱导小鼠肺脏形成NETs介导的炎症反应机制，这不仅丰富了对Mtb致病机制的进一步理解，也为结核病新型疫苗和新药的研发奠定理论基础。

结核分枝杆菌（MTB）或其早期分泌抗原ESAT-6均能诱导嗜中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）形成，且NETs可诱捕分枝杆菌但不能将其杀死，NETs的形成在分枝杆菌中的致病作用还不清楚。. 本研究在MTB胞外蛋白Rv0888具有鞘磷脂酶活性研究基础上，首次证实了该蛋白还具有核酸酶活性：在大肠杆菌中表达和纯化了MTB Rv0888蛋白，证实Rv0888蛋白发挥核酸酶活性需要二价金属离子的辅助，其最佳作用温度和pH分别为41℃和6.5，并且筛选到四种中药单体能够在体外抑制Rv0888的核酸酶活性；基于氨基酸序列分析我们发现Rv0888核酸酶与已知的胞外核酸酶没有同源性，这表明Rv0888是一个新的核酸酶；定点突变研究显示，位点H353、D387和D438氨基酸残基为Rv0888核酸酶的活性催化中心。.Rv0888NS连接pMV262穿梭载体，电转入耻垢分枝杆菌(MS)，构建重组耻垢分枝杆菌Rv0888NS/MS。以重组质粒pMV262-Rv0888NS为模板分别构建核酸酶突变体重组菌D438A/MS和鞘磷脂酶突变体重组菌H481N/MS。通过纯化蛋白的酶活性验证显示，核酸酶突变体D438A没有影响其鞘磷脂酶活性，鞘磷脂酶突变体H481N也没有影响其DNase活性。三种纯化后蛋白（Rv0888NS，D438A和H481N）分别与人嗜中性粒细胞共同孵育，其中Rv0888NS和D438A均能在体外诱导人嗜中性粒细胞形成NETs，而H481N蛋白则不能诱导NETs的形成。三种重组菌（Rv0888NS/MS，D438A/MS和H481N/MS）分别感染小鼠后发现，Rv0888NS和D438A均能提高MS在小鼠肺内的定殖能力，诱导小鼠肺内NETs的形成，在感染小鼠的肺灌洗液中检到NETs相关的MPO、Histone H4和CitH3存在，并且诱导肺的病理损伤和促进炎性细胞因子的释放。而重组菌H481N/MS感染小鼠后则无上述现象的出现。结果表明，我们找到一个新的结核分枝杆菌蛋白Rv0888，其鞘磷脂酶活性在体外和小鼠肺内均能诱导NETs的形成，并且形成的NETs诱导一系列的炎性反应和病理损伤。这些炎性反应和病理损伤主要是由MPO活化Caspase-3通路引起的，部分是由组蛋白介导的，本试验为MTB致病机制的研究提供一个新的的思路,并为TB的治疗找到一个新的药物靶标。