小动物成像监测肝脏铁调素的表达及其在储存红细胞长期输注引起的铁代谢紊乱中的应用

Long-term transfusion can easily lead to imbalance of iron metabolism in patients. Because of the different blood storage time, under the same amount of blood transfusion, the speed of iron release in the body will be significantly different, resulting in different iron metabolism process in the body. At present, the difference in iron metabolism caused by long-term infusion of red blood cells at different storage times has not been reported. Hepcidin is an important iron negative regulating hormone in the body, which is mainly synthesized by liver cells and is a key regulatory factor for maintaining the balance of iron metabolism in the body. Therefore, this study intends to establish a small animal model suitable for non-invasive imaging techniques for long-term dynamic monitoring of liver hepcidin expression in mice. We intend to adopt the method of hydrodynamic high-pressure transfection combined with the phage integrase system to integrate the reporter gene plasmid p-attB-Hepc-Fluc into the chromosome of mouse liver cells and establish a long-term monitoring system that can be monitored by live fluorescence imaging. The mouse model of hepatic Hepc expression was used to investigate the dynamic changes of hepcidin expression after long-term infusion of erythrocytes at different storage times, and to evaluate the effect of related inhibitors.

长期输血容易引起患者体内铁代谢失衡。因血液储存时间不同，在输血量相同的情况下，铁在体内释放的速度会有明显的差异，从而引起机体不同的铁代谢过程，而目前关于长期输注不同储存时间的红细胞导致的铁代谢差异尚未见报道。铁调素是体内重要的铁负性调节激素，主要由肝细胞合成，是维持机体铁代谢平衡的关键调控因子。为此，本研究尝试建立一种适用于非侵入成像检测技术的小动物模型，用以对小鼠肝脏铁调素表达量进行长期动态监测。我们拟采取水动力高压转染技术结合噬菌体整合酶系统的方法，将报告基因质粒p-attB-Hepc-Fluc特异性整合到小鼠肝细胞染色体中，建立一种能够通过活体荧光成像长期监测小鼠肝脏Hepc表达的小动物模型，用于探究长期输注不同储存时间的红细胞后机体铁调素表达的动态变化，同时评价相关抑制剂的效果。

长期反复输血会导致机体铁过载，过多的铁不但会沉积在骨髓，而且会损害肝脏、心脏和胰腺等器官的功能，甚至可能导致患者死亡。为了能够动态监测长期反复输血后铁调素（Hepc）的变化，本研究通过Hepc启动子的设计筛选结合活体荧光成像系统，建立了一种方便的、在体的、可非侵入长期监测Hepc表达水平的Hepc-Luc小鼠模型。高压水动力转染在本研究中被用于靶向肝细胞的基因递送，经小鼠尾静脉快速注射大量含目的基因质粒的生理盐水，即能够高效转染到小鼠肝细胞中。该转染方式会引起轻度的肝损伤，转染后1天血清中的ALT和AST水平迅速升高，随后下降，在转染后5-7天恢复到正常水平。转染后随着时间的延长，有部分质粒在肝细胞中会丢失，因此肝区的荧光强度逐渐减弱，Balb/c背景的小鼠在转染16天后肝区荧光强度达到稳定状态，C57BL/6背景的小鼠在转染13天后肝区荧光强度达到稳定状态。随后我们使用蔗糖铁和储存红细胞静脉回输建立铁过载模型。分别通过Elisa和Hepc-Luc小鼠模型检测Hepc的变化情况，以评估该模型是否可以反映肝脏内Hepc的表达。结果表明，通过Elisa检测到的Hepc浓度变化与借助Hepc-Luc小鼠模型得到的肝脏Hepc浓度变化趋势相吻合。此外我们还通过组织切片免疫荧光染色的方法检测了小鼠肝脏中铁调素的表达情况，我们证明了铁调素主要由肝细胞表达分泌，且表达水平的变化与借助小鼠模型得到的肝脏Hepc浓度变化趋势相吻合。最后为了验证模型小鼠是否可以长期稳定的监测肝细胞中Hepc的表达，明确随着时间的延长，转染到小鼠肝细胞中的报告基因质粒是否会被清除或者沉默，我们监测了建模2个月小鼠铁过载后肝区荧光强度的变化。结果表明，相同程度的铁过载，建模2个月小鼠肝区Hepc荧光信号的激活与建模早期小鼠得到的结果基本一致。这些结果说明Hepc-Luc小鼠模型建立成功，可长期动态反应肝脏Hepc的表达量，能够为肝脏铁调素相关的基础或者临床前研究提供可靠的动物模型。除Hepc-Luc小鼠模型外，我们还应用相似的方法成功建立了肝脏血红素加氧酶-1-Luc小鼠模型。