铁调素在金钱鱼铁代谢中的作用机理研究

Iron is essential for the survival of cell, iron disorder may cause many serious diseases. Antibacterial peptide hepcidin is responsible for iron metabolism.The research of hepcidin and iron-related protein is important and valuable.Spotted scat(Scatophagus argus) is a kind of economic fish with strong resistance. Our study is based on spotted sact. In order to explore the function of hepcidin in iron metabolism in vivo, we identify and characterize hepcidin by the analysis of protein express location and expression patterns. Combine with histochemical and cell biological technology, the function of hepcidin in iron metabolism mechanism is researched after the establishment of hepatocyte cell line, the characterization of hepcidin in iron metabolism is researched in vitro by the addition of recombinant hepcidin to over express hepcidin or RNA interference to knock down hepcidin. The protein related to iron over load and signal molecules in SMAD pathway are expected to receive by suppression subtractive hybridization. The antibacterial activity of spotted scat hepcidin is also studied by the expression of recombinant protein. Research on Spotted scat iron-related protein hepcidin may enhance the understanding of iron metabolism in seawater fish.

铁是细胞赖以生存的必需元素，铁失调会影响细胞正常生理活动，导致机体疾病的发生。铁调素是参与铁代谢并具有抗菌功能的小分子多肽。对铁调素以及铁代谢相关蛋白的研究具有重要的科学意义和应用价值。金钱鱼是一种抗逆能力极强的海水经济鱼类，本研究以金钱鱼为对象，通过组织定位铁调素并检测铁失调时铁调素的表达变化，探索金钱鱼铁调素在体内铁代谢中的作用机制。接着利用金钱鱼肝细胞系，通过添加重组铁调素以及RNA干扰沉默铁调素等技术手段从细胞水平揭示铁调素在鱼类铁代谢中的作用机理。通过抑制性消减杂交文库筛选铁超载相关蛋白以及Hep相关SMAD信号通路中的信号分子，从分子水平探索铁代谢中蛋白的作用机理。此外，通过验证金钱鱼Hep抗菌功能，揭示海水鱼类相关免疫机制。本研究结合器官水平和细胞水平阐明铁调素与铁代谢相关蛋白相互作用机制，增加了海水鱼类铁代谢研究的认识。

铁调素（Hepcidin）是参与宿主免疫，富含半胱氨酸的小分子抗菌多肽。我们克隆出两种新型金钱鱼铁调素， SA-hepcidin1和SA-hepcidin2。SA-hepcidin1属于HAMP1类，cDNA开放阅读框为273bp，编码90个氨基酸，SA-hepcidin2属于HAMP2类，cDNA开放阅读框为267bp，编码88个氨基酸。组织定位表明SA-hepcidin1主要在肝脏和脑中大量表达，在肾脏、鳃、眼、脾脏、脊索、肠、心脏、皮肤和肌肉中均有表达，而SA-hepcidin2只在肝脏中表达。此外，利用合成的金钱鱼铁调素多肽分析其体外抗菌和抗病毒功能。金钱鱼铁调素对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有相似的抗菌活性，但是SA-hepcidin1比SA-hepcidin2有更强的抗菌作用。利用鲤鱼上皮瘤细胞系（Epithelioma papulosum cyprini, EPC）和草鱼鳍细胞系（grass carp fin, GCF）检测合成的金钱鱼铁调素对鳜鱼弹状病毒（Siniperca chuatsi rhabdovirus, SCRV）和加州鲈鱼呼肠孤病毒（Micropterus salmoides reovirus, MsReV）的抗病毒性，发现SA-hepcidin2有抗病毒性，但是SA-hepcidin1没有。研究结果显示，金钱鱼铁调素是参与金钱鱼抵抗各种致病菌免疫系统的重要多功能蛋白。. 此外我们建立了金钱鱼肾细胞系（SK）并传代至40代。金钱鱼肾细胞大都为成纤维样细胞，具有正常的二倍体核型（2n=48）。金钱鱼低渗适应细胞系（SK-la）生长于低渗培养基（150 mOsm）。我们利用显微镜观察、流式细胞仪和Na+/K+-ATP酶活检测，探讨不同渗透压（150, 300 和450 mOsm）对广盐性硬骨鱼类金钱鱼肾细胞SK、SK-la和淡水硬骨鱼类草鱼肾细胞CIK形态、细胞增殖、细胞体积变化及细胞损伤的影响。实验结果表明SK、SK-la细胞比CIK细胞对渗透压应激具有更强的调节能力，对广盐性鱼类肾脏在渗透压感应及适应方面的调节机制有更深的了解。