血管平滑肌细胞中瞬间受体电位通道在钙库操纵性钙通道与钠钙交换体交互对话中作用及机制研究

Vascular smooth muscle cells (VSMCs) pathological proliferation is a key factor leading to the aged atherosclerosis-related diseases, which is regulated by cytosolic calcium concentration. Funded by National Natural Science Foundation of China, we revealed that the crosstalk between store-operated calcium channels (SOCC) and sodium calcium exchanger (NCX) regulated cytosolic calcium in the VSMCs, but mechanism of the crosstalk remained unclear. Recently, we found that SOCC induced a increase of peripheral cytosolic sodium concentration in VSMCs, which was suppressed by the pretreatment of inhibitor of transient receptor potential channels (TRPCs). Therefore, we hypothesised that TRPCs activated by SOCC mediated sodium entry, and further to induce NCX work in reverse mode. The project was designed to verify this idea. Firstly, TRPCs expression will be detected in the proliferative VSMCs, and the change of TRPCs expression will also be measured.Next, we will study the role of TRPCs in SOCC and NCX crosstalk using sodium and calcium detection technology. Finally, the main TRPCs that mediated SOCC and NCX crosstalk and the molecular mechanism will be revealed by channel blocker strategy. The aim of this research is to provide a new target for the prevention and treatment of aged atherosclerosis-related diseases.

血管平滑肌细胞(VSMCs)病理性增殖是导致老年动脉硬化相关疾病的关键因素，钙离子则是调控细胞增殖的重要物质基础。在国家自然科学基金资助下，我们揭示钙库操纵型钙通道(SOCC)与钠钙交换体(NCX)的交互作用调控着VSMCs内的钙离子浓度，但交互作用的介导机制不清。新近，我们发现激活VSMCs上SOCC，细胞内膜部的钠离子浓度升高，瞬间受体电位通道（TRPCs）抑制剂的干预降低了钠离子浓度。因此，推测SOCC激活后可能通过TRPCs导致钠离子进入激活了NCX，为验证此设想，本项目在前期基础上，利用VSMCs表型转换模型，排查TRPCs表达及变化情况；结合钠、钙离子检测技术，阐述TRPCs是否参与SOCC与NCX1的交互对话；配合通道阻断策略重点探索介导SOCC与NCX1的交互对话的TRPCs主要分子及其机制。深入揭示VSMCs病理性增殖的分子机制，为老年动脉硬化相关疾病的防治提供新的靶标。

在该项基金资助下(81601231)，我们证实：1）VSMCs增殖过程中存在着SOCC和NCX1的交互作用：研究利用大鼠球囊损伤模型，发现损伤可以诱导大鼠颈动脉NCX1表达在损伤后7天和14天上调（1.18和1.45倍），体外实验证实RNAi沉默NCX1的表达可以降低损伤诱导的VSMC的增殖。NCX1的反向工作抑制剂KBR7943可以降低血清诱导的血管平滑肌细胞增殖和钙库耗竭引起的钙内流。2）TRPC家族参与了VSMCs中SOCC和NCX1的交互作用：体外培养大鼠VMSCs上表达TRPC1、TRPC4和TRPC6，NCX1的抑制剂KBR可以抑制细胞外液Na+移除诱导的细胞内钙离子增加，RNAi抑制TRPC1的表达可以降低SOCC诱导的细胞外钙内流，但TRPC4 和TRPC6的基因敲除没有影响。在KRB干预下，TRPC1，TRPC4和TRPC6 基因沉默均没有影响SOCC诱导的细胞外钠离子内流，但当同时敲除TRPC4和TRPC6时SOCC诱导的细胞外钠离子内流被抑制。3）在人冠状动脉平滑肌细胞和内皮细胞TRPC、ORAI1和NCX三种钙调控蛋白的表达差异。通过实时荧光RT-PCR和Western blot分别检测了TRPC（TRPC1、TRPC3、TRPC4、TRPC5和TRPC6）、ORAI1和NCX（NCX1和 NCX2）钙调控蛋白在血管平滑肌细胞与血管内皮细胞中的mRNA和蛋白表达水平。结果发现TRPC6、ORAI1在血管内皮细胞中mRNA和蛋白表达水平均高于血管平滑肌细胞；TRPC4、TRPC5和NCX2在血管平滑肌细胞中的mRNA和蛋白表达水平均高于在血管内皮细胞。研究初步探明血管平滑肌细胞生物学变化中钙离子整体调控机制，为动脉硬化相关疾病提供新的治疗靶点。.研究中发表SCI论文2篇，一篇影响因子为二区4.043，另一篇影响因子三区2.898，国内统计源杂志发表2篇，会议交流10余次。正在培养博士生1人，已培养硕士研究生1人。负责人刘蓓到国外留学，建立了和美国MAYO CILINIC的合作机制。