富含半胱氨酸区（CRD）在C族GPCRs激活过程中的作用机制研究

C族GPCRs（mGluRs、GABABR等）介导中枢神经系统中重要的生理进程，其结构为组成性二聚体，每个单体都包括胞外区（VFT），HD（跨膜区）,C末端等功能域。除了GABABR和味觉受体之外，该家族受体在VFT和HD之间还包括一个富含半胱氨酸区（CRD），其激活过程为VFT结合了配体后关闭，然后通过CRD传导至HD导致其构象改变从而激活受体， CRD在激活过程中的构象变化以及如何参与VFT与HD之间的偶联目前还不清楚。本项目将建立C族GPCRs二聚体的VFTs-CRDs的三维模型并分析和确认CRDs的结合界面，然后在结合界面上定向突变可能参与CRDs构象变化的残基，通过检测不同突变体的功能改变以及解析失活或组成性活性突变体中所发生的结构改变，从而分析CRDs参与激活过程中的构象变化和分子机制。本项目有助于更好了解该家族受体的激活机制和细节，也为以该家族成员为靶点的药物筛选提供新思路。

C族G蛋白偶联受体包括代谢型谷氨酸受体（mGluRs）、代谢型γ-氨基丁酸受体（GABABR）等，在体内介导中枢神经系统中多种重要的生理进程和病理进程。该族受体中mGluR可以形成同源二聚体而GABABR则是通过GB1和GB2亚基形成异源二聚体。结构上，受体的不同亚基都包括胞外区（VFT），跨膜区（HD）,C末端等功能域， mGluR在VFT和HD之间还包括一个半胱氨酸富集区（CRD），目前并不清楚CRD的构象变化及如何参与VFT与HD之间的偶联。而不具有CRD区的异源二聚体GABABR，膜外GB1-VFT结合配体后的构象变化如何传导到GB2亚基的HD区，乃至于引发什么样的膜内下游分子事件，也有待深入研究。此外，在某些特定组织和特定发育时期中GB1亚基可以形成同源二聚体，对于这种同二聚体的功能还一无所知。本项目在实施过程中，项目组成员首先建立了带有CRD的C族GPCRs二聚体的VFTs-CRDs的三维模型，并分析和确认了CRDs中的维持结构的保守残基和在CRD-CRD结合界面上参与激活进程构象变化的残基，然后在这些位点进行定向突变。进而通过检测不同突变体的功能改变以及解析失活或组成性活性突变体中所发生的结构改变，从而证实CRDs中完整的空间结构以及与VFT之间的正常折叠对于CRD参与受体的激活过程是必须的，同时在C族受体同二聚体激活过程中两个CRD单体间会发生沿着二聚体结合界面的靠近和切向的旋转（PNAS., 2011)。同时，项目组成员合成了一种可以共价稳定结合于GB1-VFT带有生物素标记的紫外光敏分子探针。利用该探针，项目组成员检测了GABABR在激活状态下膜外构象变化传导到膜内后，受体与IGFR、FAK等其他受体或信号蛋白之间的动态组装和解聚过程。该工作提供了一种可用于检测GPCR激活进程信号通路的化学生物学工具，也使我们更清晰的理解了GABABR激活过程中的构象变化和分子机制（Biochem J., 2012）。项目组成员还检测了GB1亚基形成同源二聚体在激活后的功能构象变化，结果表明，GB1亚基形成的同源二聚体上膜后也可以激活下游信号通路（PLoS One., 2012)。本项目的完成有助于更好的了解该族受体的激活机制和细节。