APC基因同义突变SNP在家族性腺瘤性息肉病中的机制研究

Familial adenomatous polyposis (FAP) is a kind of hereditary colorectal cancer with bad prognosis, it has a typical process of polyps-adenomaadenocarcinoma, which is the best model to study the pathogenesis of colorectal cancer. It is established that FAP is mainly caused by APC gene mutations through the activation of Wnt signaling pathway. We previously have conducted exon sequencing of APC, MUTYH and AXIN2 gene in 21 FAP patients, unexpectedly,no already-known pathogenic mutation found in 80% patients, however,5 synonymous SNPs (sSNPs) of APC gene were found, further analysis of these polymorphisms by bioinformatics suggest that these sSNPs can impact the function of exon plicing enhancer (ESE) at mRNA level and cause exon skipping of APC, and then the truncated APC protein result in FAP, therefore, we assume that these sSNPs may be the pathogenic changes predisposing to FAP. In order to study the relationship between sSNPs and FAP, we propose exon skipping assay to verify whether these sSNPs can lead to APC protein truncating, then ESE dependent experiments will conduct to investigate the mechanism of exon skipping. Moreover, APC mutants with mt and wt sSNPs are designed to knock in normal intestinal epithelial cells and tumor cells by CRISPR-CAS9 method and then the tumor cells are inoculated into mice to investigate the function and phenotype. Biochemical and transcriptomic methods are designed to analyze the signaling network of these sSNPs.

家族性腺瘤样息肉病（FAP）是一种预后极差的遗传性大肠癌，是研究大肠癌的极佳样本。APC基因致病性突变导致的Wnt通路活化，是导致FAP的主要病因之一。申请人前期对21个FAP患者的APC（包括MUTYH与AXIN2）外显子进行测序分析后，在80%患者中未检测到致病性突变。而前期结果显示患者体内Wnt通路被持续活化，部分患者未检测到APC全长mRNA的表达。通过生物信息学深入分析APC测序结果，筛选出5个既往被认为是沉默突变的APC同义突变SNP（sSNP），部分突变预测功能是在mRNA水平影响APC外显子剪切，使蛋白截短导致FAP，申请人拟通过外.显子剪切试验研究这些sSNP的功能与机制。同时利用CRISPR/CAS9等技术将其他未知功能的sSNP导入正常或大肠癌细胞系，研究其对细胞增殖、迁移和侵袭功能的影响，通过裸鼠成瘤实验研究其生理功能，利用生化和转录组学等方法解析突变。

家族性腺瘤样息肉病（FAP）是一种预后极差的遗传性大肠癌，是研究大肠癌的极佳样本。APC基因致病性突变导致的Wnt通路活化，是导致FAP的主要病因之一。申请人前期对21个FAP患者的APC（包括MUTYH与AXIN2）外显子进行测序分析后，在80%患者中未检测到致病性突变。而前期结果显示患者体内Wnt通路被持续活化，部分患者未检测到APC全长mRNA的表达。通过生物信息学深入分析APC测序结果，筛选出5个既往被认为是沉默突变的APC同义突变SNP（sSNP），部分突变预测功能是在mRNA水平影响APC外显子剪切，使蛋白截短导致FAP。.基于同义突变在其他疾病中的作用被逐渐认识并结合我们自身的研究发现，我们认为，将本研究中的APC-sSNP进一步定位并进行相应功能研究可能为解释既往常规筛查手段认定为APC(-)/FAP患者的致病原因提供理论依据，相关研究结果同时可作为其他散发性大肠癌基因筛查的靶标。本研究首先通过外显子异常剪切实验等对候选的5个APC-sSNP进行了检测，实验结果证实，其中，APC G1548A点突变可引起APC基因的外显子发生异常跳跃，因此，我们对APC G1548A点突变这一APC-sSNP进行了后续的细胞及动物水平的研究。通过构建APC-G1548A点突变的结直肠癌细胞SW480和SW620，项目组发现在APC的1548位点的A突变为G（APC G1548A）后，SW480和SW620结直肠癌细胞的增殖、侵袭、迁移以及克隆形成水平显著上调。此外，通过蛋白免疫印迹和荧光定量PCR实验检测WNT/β-Catenin信号通路相关蛋白，发现蛋白表达水平升高。小鼠实验进一步证明APC-1548G促进肿瘤的形成以及WNT/β-Catenin信号通路相关蛋白上调。.此研究结果为揭示既往常规筛查手段认定为APC(-)/FAP患者的致病原因提供理论依据，APC基因致病性同义突变SNP（APC G1548A）可作为肠癌基因筛查的靶标，本项目研究结果国内外未见报道。