肝星细胞维生素A脂质滴形成机制与Niemman-Pick 病因关联的研究

维生素A缺乏仍然是我国儿童营养的重要问题，先天性代谢遗传病尼曼匹克病NPD与脂代谢密切相关。根据肝星细胞维生素A脂质滴在肝纤维化时消失的线索，我们推测作为维生素A脂质滴形成分子机制可能与NPD病因相关。本研究分离并培养大鼠肝星细胞及NPD患者皮肤纤维母细胞，制作肝星细胞维生素A脂质滴和NPD纤维母细胞蓄积脂质囊泡，重构并转染突变NPD基因到Cos-1细胞，用共焦显微镜观察细胞内脂质分布，定量细胞RE和ASM,用斑点质量分析法进行脂质滴蛋白质回收和鉴定，观察和比较维生素A脂质滴和NPD脂质蓄积异同，通过1.观察脂质分布的形态学；2.鉴定细胞内视黄醇酯RE和ASM活性;3.探讨PAT蛋白及以往研究证明的维生素A相关酯化酶，结合蛋白质，检索二种脂质滴特异性局在蛋白。发展目前关于脂质滴机能的研究；探索维生素A脂质滴形成的分子机制；解明其与NPD病细胞内脂质蓄积的关联。

根据维生素A贮藏细胞的肝星细胞内维生素A脂质滴形成机制可能与NPD病因学相关的推测。本研究分离并培养大鼠肝星细胞及尼曼匹克病患者皮肤纤维母细胞，制作肝星细胞维生素A脂质滴和NPD纤维母细胞脂质滴，用共焦显微镜观察细胞内脂质分布，定量细胞RE和ASM,用斑点质量分析法进行脂质滴蛋白质回收和鉴定，观察和比较维生素A脂质滴和NPD脂质蓄积异同，获取了大量珍贵的病理基础资料，初步掌握了我国的尼曼匹克病流行病学特征。课题组在南京医科大学第二附属医院建立了高效液相色谱维生素A,E的分析法，解明了维生素A，E在尼曼匹克病患者量的水平的关联性；依托课题组收集到来自全国各地的各型各阶段临床表现各异的尼曼匹克病患者患者就诊，进行皮肤纤维母细胞菲律宾染色，准确分型诊断B,C型，分析了尼曼匹克病基因突变位点，筛选中国人尼曼匹克病常见突变点；发现个别国内外未见报道的新突变位点。确定了特殊高血脂患儿血清和肝脏组织维生素A呈现极高水平，虽然临床无症状，基因检测酸性磷酸鞘脂酶及NPC1基因重合突变，检索近文献未见相关报道，结果正在进一步反复验证中。本研究显示发生了肝脏星细胞活化的B型尼曼匹克病患者血清维生素A降低，而维生素A（视黄醇酯和视黄酰酯）均极度高水平的特殊高血脂尼曼匹克病肝脏星细胞并未发生活化。提示了尼曼匹克病肝脏星细胞维生素A脂质滴形成和转运并不单纯只是在肝硬化时消失那样简单，而可能存在双向调节的多样性。值得进一步研究。