基于脂滴-线粒体自噬关联作用探讨肝纤维化细胞能量代谢调控机制及扶脾柔肝方的干预研究

The core of hepatic fibrosis is hepatic stellate cell (HSC) transformed into the myofibroblast (MFB) by epithelial-mesenchymal transition (EMT).During the activation of HSC, the lipid droplet autophagy was strengthening and the mitochondria autophagy was weakening. We supposed that the correlation interaction of lipid droplet-mitochondria can provide energy for HSC transformed into MFB.This research is based on the theory of the correlation between liver and spleen. We discuss the pathological mechanism of HF and the intervention mechanism of ‘Fupi Rougan’ particles from ‘lipid droplet-mitochondria- energy metabolism’ by interposing the lipid droplet-mitochondria autophagy link. In vivo and in vitro experiment, we tested the lipid droplet-mitochondria-lysosome shaft, AMPK/mTOR signaling, and the expression of Beclin 1、LC3-Ⅱ、AMPK、mTOR、PINK1、Parkin、PLIN、ADRP、ATGL、HSP60、TOM20 、E-cadherin、a-SMA which were the key signaling molecules of PINK1/Parkin signaling by using the electron microscope, fluorescence labeling, Western Blot and fluorescent quantitative PCR methods. By discussing the correlation interaction in the process of lipid droplet-mitochondria autophagy, which provided energy for HSC activation to reveal the correlation between liver and spleen theory in TCM and provide the basis for the action mechanism of ‘Fupi Rougan’ particles.

肝纤维化(HF)的核心在于肝星状细胞(HSC)通过上皮间质转化转变为肌成纤维细胞（MFB）。HSC活化过程中，脂滴自噬加强，线粒体自噬减弱，我们假说脂滴-线粒体关联协同作用为HSC转变为MFB提供能量。本研究基于“肝脾相关”理论，通过干预“脂滴-线粒体”自噬环节，从能量代谢角度探讨HF的病理机制及扶脾柔肝方的干预机制，通过体内外实验，运用电镜、荧光标记、免疫印迹及荧光定量PCR方法检测脂滴-线粒体-溶酶体轴、AMPK/mTOR通路、PINK1/Parkin通路中关键的信号传导分子Beclin 1、LC3-Ⅱ、AMPK、mTOR、PINK1、Parkin、PLIN、ADRP、ATGL、HSP60、TOM20 、E-cadherin、a-SMA的表达情况，探讨脂滴-线粒体在自噬过程中为HSC的活化提供能量的关联协同作用，为揭示中医“肝脾相关”理论及扶脾柔肝方治疗HF的作用机制提供依据。

肝纤维化是多种慢性肝病发展成肝硬化的的共同病理基础和必经路径，以肝组织内细胞外基质过度增生和异常沉积为特征。脂滴-线粒体-溶酶体是能量代谢中的关键细胞器，在能量代谢过程中具有关联协同作用，是肝纤维化过程中肝星状细胞活化的关键机制。因此从脂滴-线粒体-溶酶体自噬途径探讨肝星状细胞活化的分子机制，有利于深入了解肝纤维化的细胞分子病理机制，为肝纤维化的治疗开辟新的路径。.本研究基于“肝脾相关”理论，通过干预“脂滴-线粒体-溶酶体”自噬环节，从能量代谢角度探讨HF的病理机制及扶脾柔肝方的干预机制。将扶脾柔肝方进行拆方，分为扶脾柔肝方、扶脾方、柔肝方，并以之作为基础干预手段。建立肝纤维化动物模型及肝星状细胞活化模型，同时对自噬的线粒体、脂滴、溶酶体三个关键环节进行干预。检测脂滴-线粒体-溶酶体自噬、AMPK/mTOR 通路、 PINK1/Parkin 通路、能量代谢中关键的信号传导分子的表达情况。探讨脂滴-线粒体-溶酶体在能量代谢中的关联协同作用，从“脂滴-线粒体-能量代谢”角度揭示肝纤维化的病理生理机制，揭示扶脾柔肝、扶脾、柔肝法对“脂滴-线粒体-能量代谢”调节的作用机制，为抗肝纤维化治疗提供新的理论依据。.动物实验研究结果显示，在大鼠肝纤维化模型中，扶脾柔肝方及其拆方扶脾方、柔肝方具有抗肝纤维化，降低肝纤维化血清标志物，对肝纤维化脂滴-线粒体-溶酶体自噬、AMPK/mTOR 通路、PINK1/Parkin 通路具有调节作用。.体外细胞实验结果显示，扶脾柔肝方及其拆方扶脾方、柔肝方含药血清对HSC活化模型细胞脂滴-线粒体-溶酶体自噬、AMPK/mTOR 通路、PINK1/Parkin 通路具有调节作用。