DJ-1蛋白对弱精症精子中线粒体功能的影响及其机制研究

Asthenospermia (AS) is closely related to oxidative stress. DJ-1 protein plays an antioxidant stress function by oxidation of intra molecular cysteine residues. Our research group has confirmed that in sperms from AS patients, DJ-1 protein levels decreased which was positively correlated with sperm motility. In addition, the isoelectric point of DJ-1 protein was reduced, suggesting an increased oxidation level of DJ-1 protein. These findings indicated that the DJ-1 protein is related with AS. Recently, we obtained an important discovery that the DJ-1 protein in sperms was translocated to mitochondria, indicating that the protein may be involved in mitochondrial function. Based on the results above, we plan to quantitatively analysis the different oxidation degree of DJ-1 protein, including Cys106-SH, -SOH, -SO2H and -SO3H in AS sperm with biological mass spectrometry, detect the relationship structural changes induced by Cys106 oxidation and DJ-1 protein translocation to the mitochondria using FRET and immunoelectron microscopy, identify mitochondrial translocation protein related DJ-1 protein applying biological mass spectrometry, and evaluate the changes of mitochondrial function. We also investigate which stage of spermatogenesis DJ-1 protein translocation to mitochondria occur in by the animal model. Therefore, we may clarify the effects and mechanism of DJ-1 proteins on mitochondrial function of AS sperm, and establish experimental foundation for discovering new drug target of AS.

弱精症与氧化应激损伤密切相关。DJ-1蛋白是一种通过分子内半胱氨酸残基氧化而发挥抗氧化应激作用的蛋白。本课题已证明，弱精症患者精子中DJ-1蛋白表达减少；且等电点降低，间接反映DJ-1蛋白氧化程度增高，揭示了DJ-1蛋白与精子活力相关。近期本课题组又有了重要发现：在弱精症患者精子中DJ-1蛋白发生向线粒体转位，提示该蛋白可能调节了线粒体的功能。因此，本课题将利用生物质谱定量分析弱精症精子中Cys106-SH、-SOH、-SO2H和-SO3H氧化态DJ-1蛋白；FRET和免疫电镜检测氧化态DJ-1蛋白的结构变化与其向线粒体转位的相关性；Co-IP结合生物质谱筛选与DJ-1蛋白向线粒体转位相关的相互作用蛋白；同时评价线粒体功能。并通过动物模型明确DJ-1蛋白向线粒体转位存在于精子生发过程中的哪个阶段，以期阐明弱精症精子中DJ-1蛋白对线粒体功能的影响及其机制，为弱精症治疗靶点的发现提供依据。

随着现代社会环境污染、工作和生活压力增加，不孕不育患者逐年增多，在我国已成为一个日益严重的社会问题，其中，弱精症在男性不育发病率中呈现较高比例，而且弱精症的临床治疗效果不佳。因此，深入研究弱精症的发病机制，发现新的治疗靶点是当务之急。弱精症的发生与氧化应激损伤密切相关，如何保持活性氧的产生和清除之间的平衡已成为近年研究的热点之一。DJ-1蛋白，作为一种内源性生物活性物质，与雄性生育能力密切相关，而且它的抗氧化能力也已得到证实，但其在人类弱精症发病过程中的具体作用尚未被研究。本课题聚焦DJ-1蛋白对弱精症精子中线粒体功能的影响及其机制研究，首先利用western blotting及免疫荧光技术发现了弱精症患者精子中DJ-1蛋白与线粒体复合物I（CI）中的NDUFS3蛋白同时显著性减少，生物质谱分析显示DJ-1蛋白氧化态水平增高，线粒体CI活性被抑制且膜电位降低，初步确定DJ-1蛋白对线粒体的保护功能；随后通过生殖毒素奥硝唑（ORN）建立弱精症大鼠模型，检测精子及睾丸组织中DJ-1蛋白表达水平及精子线粒体功能改变，得到与弱精症患者精子样本相似的实验结果，明确了DJ-1蛋白参与了线粒体保护功能；最后利用免疫共沉淀技术探讨了DJ-1蛋白对弱精症精子线粒体的保护作用机制，发现DJ-1蛋白可直接与CI的NDUFS3蛋白相互结合，很可能是DJ-1发挥线粒体保护作用的关键点。本课题的以上研究结果进一步完善了弱精症的发病机制，也为发现弱精症治疗的新靶点提供了实验依据。