Wnt/β-catenin信号通路在异常核型人胚胎干细胞向肿瘤演进过程中相互作用网络研究

体外长期培养的人类胚胎干细胞可能会发生由单一片段重复向复杂重排的染色体变异，甚至向恶性转变, 这一渐进性变化为研究肿瘤细胞的发生与演进提供了良好的模型。课题组前期对建立的人胚胎干细胞系chHES-3发生染色体变异过程中不同阶段的细胞系以及人胚胎癌细胞NTERA-2系进行研究, 发现这些细胞系存在Wnt信号异常激活。本课题拟以上述细胞系为材料，采用Tet-on 调控RNAi与靶向蛋白质组学研究策略，首先分析β-catenin干扰后下游靶基因、细胞生物学特征、细胞自我更新与多向分化能力、畸胎瘤恶性程度等改变，再采用靶向蛋白质组学技术分离鉴定β-catenin的相互作用蛋白质，并采用生物信息学工具描绘β-catenin蛋白涉及的信号网络。项目研究不仅有助于揭示Wnt/β-catenin信号通路在异常核型人胚胎干细胞向肿瘤演进过程中的作用及作用机制，而且能为人胚胎干细胞安全性问题的解决提供新线索。

本项目以正常核型、单纯1号染色体重复、染色体复杂重排核型的chHES-3和人胚胎癌细胞NTERA-2四株细胞系为研究对象，首先运用ITRAQ定量蛋白质组学动态分析人胚胎干细胞（hESCs）体外恶性转化过程，从2583个蛋白中分离鉴定了316个差异显著蛋白，结果提示异常核型hESCs的恶性转化其过程与DNA甲基化、组蛋白乙酰化、Wnt信号通路有密切的关系，β-catenin与HDAC2可能作为潜在的hESCs恶性转化标记蛋白质；然后运用慢病毒载体建立了稳定的β-catenin干扰细胞系，比较干扰前后β-catenin下游靶基因表达、细胞生物学特征、自我更新和分化潜能的改变，发现β-catenin稳定干扰细胞系的细胞生物学特征有明显改变，细胞周期减慢、增殖能力明显下降、细胞分化能力下降、端粒缩短、端粒酶活性下降，进一步证实β-catenin与hESCs细胞自我更新与多能性密切相关；再者，将干扰后的细胞进行了表达谱分析，高通量的分析β-catenin涉及的信号网络，深入地探寻β-catenin的作用机制；在进一步探寻β-catenin调控hESCs自我更新与多能性的研究中，我们发现在hESCs体外培养早期端粒延长依赖于受Wnt–β-catenin信号调控的端粒酶活性，是hESCs获得自我更新能力的自然过程；我们还发现β-catenin与线粒体的功能密切相关参与调控细胞增殖能力，因此，建立了一种精确定量hESCs线粒体DNA 拷贝数的方法，为研究不同条件下对hESCs线粒体DNA 拷贝数的影响奠定研究基础；项目研究发现β-catenin干扰使hESCs多向分化潜能受到影响，而Nodal/activin信号的核心蛋白SMAD2与β-catenin关系十分密切，分析发现SMAD2作为关键因子，磷酸化激活并介导了Activin A诱导hESCs向限定性内胚层分化，转录调控Brachyury和Sox17的表达；针对干细胞培养过程中存在解冻后细胞复苏效率较低及安全性问题，通过设计干细胞多功能培养板及其吸取器，提高干细胞培养及复苏效率，获得了授权专利二项，对提高干细胞大规模生产效率及节约成本起重要的作用。本项目发表SCI论文3篇，CSCD论文4篇，其他论文1篇，获得专利2项，参加了第10届国际干细胞协会（ISSCR）学术年会，培养硕士研究生2名。