利用少弱精症特异hESC研究关键基因对精子发生的影响及作用机制

There are crucial genes for spermatogenesis on human autosomes. However most of them, as well as their function mechanisms are unknown because of ethical restriction on human research. Human embryonic stem cells (hESCs) can differentiate into germ cells in vitro. And the differentiation processes reflect the development behaviors in vivo. Thus hESC is an good model to investigate the regulation mechanism of spermatogenesis. An asthenospermia-specific hES line (CCRM27) was established in our lab：it derived from embryo with 46，XY，t（1；18）（p12；q22） karyotype, donated by a couple suffered from severe asthenospermia; it shows typical hESC’ characterizations and with normal karyotype 46，XY; however, the RNA and protein expression level of DAZL key gene for spermatogenesis was repressed during CCRM27 differentiation into sperm cells.We hypothesis that there is a second balanced translocation between chr. 1 and Chr. 18 at the same breakpoints.Thus the CCRM27 karyotype looks “normal”, however genomic DNA microdeletion arise at the breakpoints on which important genes for spermatogenesis reside. We further predict that the deleted key genes regulate spermatogenesis through DAZL. Induced sperm cells differention, high precision genomic DNA/mRNA sequencing, cell and animal level experiments will be employed to testify our speculation.

人类常染色体上存在精子发生关键基因，但为医学伦理所限，多数基因及其作用尚不明了。人类胚胎干细胞（hESC）可体外分化为精子细胞，是研究人类精子发育调控的理想模型。本项目组前期建立了少弱精症特异hES系（CCRM27）：该系来源胚胎核型为46，XY，t（1；18）（p12；q22），其捐赠父亲患少弱精症；CCRM27具有hESC的典型特征且G带分析显示正常核型（46，XY）；其向精子分化过程中，精子发生关键基因DAZL的表达显著下调、DAZL阳性细胞比例降低。我们推测：CCRM27建系过程中，1、18号染色体发生二次易位恢复“正常”核型，但易位断裂点缺失了精子发生关键基因，致体外精子分化异常；该关键基因可能通过DAZL起作用。本项目将通过诱导分化技术明确CCRM27向精子分化特征，同时利用高精度测序技术捕获易位断裂点上调控精子发生的关键基因，并进一步在细胞及小鼠模型上验证其作用及机制。

世界范围内5-7%男性不育，不育症已成为重大健康问题，亟待明确病因、寻求有效防治手段。至少15%的不育患者存在基因变异，但为医学伦理所限，多数基因及其作用机制尚不明了。人类胚胎干细胞（hESC）可体外分化为男性生殖细胞，是研究人类精子发育调控的理想模型。本项目利用不育患者夫妇捐献的胚胎建立少弱精症特异hESC株系，体外诱导其向男性早期生殖细胞分化并明确分化是否受到影响，然后通过转录组学、基因组学分析捕获关键基因并探讨作用机制。我们建立了系列少弱精症特异hESC株系，包括：（1）来源胚胎及建成株系均为染色体罗氏易位CCRM16；（2）来源胚胎为常染色体平衡易位、 建成株系为正常染色体核型CCRM27；（3）来源胚胎及建成细胞株均为正常染色体核型CCRM533、CCRM534、CCRM535、CCRM538、CCRM539。其中CCRM16、CCRM27、CCRM538、CCRM539完成了多能性鉴定以及2uM维甲酸体外诱导向男性早期生殖细胞分化特征分析。4株细胞均高表达多能性标记基因OCT4、NANOG、TRA-1-181以及SSEA4，可分化为3胚层来源组织。体外诱导分化结果显示CCRM16、CCRM27、CCRM538、CCRM539的原始生殖细胞（PGCs）分化受到抑制，提示生殖细胞发生障碍；高通量基因组测序显示4株细胞均不存在DNA大片段缺失(>4Mbp)。进一步分析生殖细胞分化不同时间点（D0、D2、D4）的CCRM539转录组，发现生殖细胞发生、发育相关信号通路基因在未分化时期（D0）以及分化早期（D2）表达下调，包括TGF-β、Notch、Wnt、m-TOR、干细胞多能性调控信号通路基因以及GnRH、雌激素（Estrogen）生殖内分泌信号通路基因。进一步捕获关键基因并进行细胞水平、动物水平作用机制验证，可望为不育症的诊治提供新靶点。