内质网应激在神经节苷脂减轻布比卡因神经毒性中的作用

Bupivacaine is a commonly used local anesthetic in spinal anesthesia and its neurotoxicity is the focus of clinical anesthesia. Our preliminary study have found that ganglioside (GM-1) has protective effects on the nervous system,because it can reduce the bupivacaine-induced neurotoxicity and the apoptosis rate of neuroblastoma cell. The research thought GM-1 against apoptosis caused by endoplasmic reticulum stress (ERS) through down-regulating the expression of Caspase-12 and CHOP. Therefore, our research observe the change of the related protein levels of ERS protective signaling pathways and apoptosis pathway in the animal models of bupivacaine-induced neurotoxicity and the culture of human neuroblastoma N2a cell in vitro, with CCK 8, TUNEL, flow cytometry, Hoechst 33258, qRT-PCR, immunocytochemistry, Western blot, laser confocal microscope and immunofluorescence method. To revealing the role of ERS in bupivacaine-induced neurotoxicity and the possible molecular mechanisms of the GM-1 protective function, and establishes a theoretical basis for the prevention and control of local anesthetics neurotoxicity.

布比卡因是椎管内麻醉中较为常用的局部麻醉药，其产生的神经毒性是临床麻醉关注的焦点。我们前期的实验发现，神经节苷脂（GM-1）可减轻布比卡因诱发的脊髓神经毒性、降低神经母细胞瘤细胞的凋亡率，对神经系统具有保护作用。有研究认为，GM-1通过下调Caspase-12及CHOP的表达而对抗内质网应激（ERS）引起的凋亡。因此，本研究通过建立布比卡因脊髓神经毒性动物模型和体外培养人神经母细胞瘤N2a细胞株，以CCK-8、TUNEL、流式细胞仪、Hoechst 33258、qRT-PCR、免疫组化、Western blot、激光共聚焦显微镜及免疫荧光等方法观察GM-1预处理对ERS保护性信号传导通路及凋亡途径相关蛋白表达的影响，揭示ERS在布比卡因脊髓神经细胞毒性中的作用以及GM-1发挥细胞保护作用的可能分子机制，为防治局麻药神经毒性奠定理论基础。

布比卡因是椎管内麻醉中较为常用的局部麻醉药，其产生的神经毒性是临床麻醉关注的焦点，针对局麻药神经毒性的机制和治疗研究具有重要意义。神经节苷脂（GM-1）可减轻布比卡因诱发的脊髓神经毒性、降低神经母细胞瘤细胞的凋亡率，对神经系统具有保护作用。内质网应激是否参与局麻药神经毒性的发生和GM-1细胞保护作用需要深入研究。本研究通过建立布比卡因脊髓神经毒性动物模型和体外培养人神经母细胞瘤N2a细胞株，以CCK-8、TUNEL、流式细胞仪、qRT-PCR、免疫组化、Western blotting、激光共聚焦及免疫荧光等方法观察内质网应激在布比卡因脊髓神经毒性中的作用及GM-1发挥细胞保护作用的可能分子机制。结果：①布比卡因神经毒性模型的建立可使大鼠后肢感觉和运动功能受损、N2a细胞超微结构变性，细胞活性降低及凋亡率明显升高。②大鼠脊髓神经毒性模型上，内质网应激信号途径Grp78/PERK/eIF2α/ATF4 及IRE1α相关分子p-IRE1α、ASK1、TRAF2、p-JNK，转录因子CHOP及关键分子caspase-12 mRNA和蛋白表达水平明显升高。③体外细胞实验显示布比卡因可使损伤细胞的膜电位绿色荧光增加，内质网应激信号途径PERK/eIF2α/ATF4 相关因子蛋白及凋亡通路CHOP、JNK及其磷酸化水平、caspase-12 mRNA和蛋白表达水平明显升高。④GM-1预处理后可使大鼠脊髓组织、N2a细胞超微结构的损伤逐渐改善，细胞活力增加，细胞凋亡率下降，以及内质网应激诱导的信号通路、转录因子及关键分子的表达水平从3d～7d开始明显降低。揭示了内质网应激的生存信号途径和凋亡途径参与了布比卡因神经毒性作用的形成过程，且神经节苷脂预处理可以通过抑制内质网应激相关途径因子的表达发挥对布比卡因神经毒性的保护作用。研究结果为局麻药神经毒性的治疗提供新思路。