GALNT2介导的蛋白O-糖基化修饰在uMSC来源外泌体肝损伤修复效应中的意义及其机制研究

Mesenchymal stem cells (MSC) are important for the treatment of end-stage liver disease, but its effects and mechanisms need to be further clarified. Our previous study found that umbilical cord derived MSC secreted exosomes (uMSC-Exos) played key roles in liver damage repairing, and preliminarily confirmed that O-linked glycosylation of proteins in uMSC-Exos, such as FGF and so on, promoted hepatocyte proliferation and increased the resistance to apoptosis. Therefore, this project intends to use the lectin chromatography, CRISPR/cas9 gene knockout and some other strategies to firstly verify the role of N-acetylgalactosaminyltransferases (GALNT2) regulated O-glycosylated modification in the uMSC-Exos’ efforts for hepatoyte proliferation, and further clarify the O-glycosylation levels of key protein factors espcially the FGF, and their influence on the functions of uMSC-Exos and the underlying mechanism. Finally, using in vivo assessment, to confirm the role of O-glycosylated protein modification for the uMSC-Exos liver damage repairing efficacy. This study is expected to increase our understanding about how the protein glycosylation and MSC-hepatocyte communication affect the liver injury repair, and may provide a new reference and candidate target for the translational studies of uMSC-Exos in the clinical treatment of liver diseases.

间充质干细胞(MSC)用于终末期肝病治疗具有重要的研究潜力，但其效应与机制均有待进一步阐明。我们前期研究发现脐带来源MSC分泌的外泌体（uMSC-Exos）具有显著的肝损伤修复效应，并初步证实O-糖基化修饰的FGF等蛋白成分是uMSC-Exos促进肝细胞的增殖并抵抗凋亡的关键成分。因此，本项目拟运用凝集素层析等糖组学技术、CRISPR/Cas9基因敲除等研究策略，首先验证N-乙酰氨基半乳糖转移酶（GALNT2）调控的蛋白O-糖基化修饰对于uMSC-Exos促肝细胞增殖作用的影响，并进一步明确FGF等关键因子的O-糖基化水平对uMSC-Exos功能的影响与机制，最终通过在体试验评估蛋白O-糖基化修饰对于uMSC-Exos肝损伤修复疗效的意义。本研究有望从蛋白糖基化修饰及干细胞-肝细胞间通讯的角度增加对肝损伤修复机制的认识，并为uMSC-Exos在肝病治疗中的转化研究提供新的参考和候选靶点。

肝纤维化是慢性肝脏病发展的一个重要阶段，且可能引起不良愈后，给国民带来沉重的负担，遗憾的是当患者发展为肝硬化阶段，除肝移植外，目前仍缺乏有效的治疗有段。由于干细胞具有抗炎、促进组织再生、促进血管生成等特性，近年在临床治疗中蓬勃发展。研究表明干细胞主要是通过旁分泌作用促进组织功能修复，其中外泌体是重要的分泌物质。本项目主要针对外泌体糖蛋白开展了一系列研究。糖链结构多样性决定了糖蛋白结构的复杂性，而外泌体作为细胞间的通讯方式，其糖链的作用尤为重要。.本项目首先通过超速离心法分离纯化uMSC、bMSC、HepG2及293T细胞外泌体，应用WB、qNano和透射电镜鉴定外泌体特性；通过建立肝细胞损伤模型，明确干细胞外泌体对肝损伤修复作用；应用荧光染色定位，明确干细胞外泌体在靶细胞中的定位；通过凝集素芯片及凝集素印迹法分析比较四类外泌体糖结构丰度差异，明确发挥组织损伤修复的关键糖结构；应用基因编辑技术针对特征性糖结构催化酶工程化改造，建立优化的干细胞外泌体应用于肝组织修复。.应用WB、qNano和透射电镜技术证实通过超速离心纯化的外泌体符合常规定义外泌体，表达特异性分子CD63和CD9，粒径主要分布为118.3±37.8nm，浓度为9.67x1010 particles/ml；研究表明双氧水能成功诱导人正常肝细胞（L02和WRL68）凋亡和ROS水平升高，应用外泌体作用后，细胞的凋亡显著减少。TGF-β成果诱导肝星状细胞LX2激活，应用外泌体作用后，显著降低α-SMA表达抑制LX2激活；免疫荧光证实干细胞外泌体能够进入肝细胞内部发挥作用；凝集素芯片与印迹法均证实干细胞外泌体SNA和ConA的结合率显著高于对照组。qPCR的结果发现8种催化产生α-2,6-唾液酸糖结构的酶中，ST6Gal-2的表达在干细胞外泌体中最高，通过体外酶切证实，酶切后外泌体抑制肝细胞凋亡及星状细胞活化的效果减弱。.本项目研究表明，干细胞外泌体对肝纤维化的恢复有促进作用，其中糖基化修饰起到至关重要的作用，为阐明外泌体治疗肝纤维化其机制提供重要的理论依据，为干细胞外泌体在肝病治疗中的临床转化研究提供新的参考。