外泌体介导HCV蛋白诱导肝纤维化的作用与机制研究

Chronic hepatitis C virus (HCV) infection is a major cause of liver fibrosis. Hepatic stellate cells (HSC) are key mediators of liver fibrosis. The direct role of HCV in the liver fibrogenic process remains unclear. HSC are not permissive for HCV entry and replication, whether HCV proteins can enter HSC through other routes is unknown. Exosomes are membrane vesicles released into extracellular environments by live cells, which play important roles in intercellular communication through transferring of functional proteins and RNAs. In this proposed study, we hypothesize that HCV proteins can be delivered to HSC through exosomes and induce liver fibrosis. Firstly, we will co-culture HCV-infected hepatocytes or exosomes from the culture medium of HCV-infected hepatocytes with human HSC, the expression of cytokines, such as TNF-α, IL-1β and activation marker α-SMA in HSC will be measured. Secondly, exosomes from hepatocytes with expression of HCV proteins will be used to treat HSC to determine which HCV protein is dominate in inducing HSC activation. Finally, we will investigate the mechanism(s) of the induction of liver fibrosis by HCV proteins through blocking the activation of several inflammatory signaling pathways (NF-κB, JNK). Our study will provide theoretical and experimental evidences to reveal the direct role of HCV in the liver fibrogenic process.

慢性丙型肝炎病毒（HCV）感染是引发肝纤维化的主要病因之一。肝星状细胞（HSC）是介导肝纤维化发生的首要细胞。HCV的直接致肝纤维化作用和机制尚不清楚。HSC并不支持HCV的进入与复制，HCV蛋白是否可以通过其它方式进入HSC并激活HSC还有待证实。外泌体是活细胞释放到细胞外基质的小囊泡体，其重要作用是通过传递其内容物（蛋白质、RNA等）介导细胞间的通讯。我们假说外泌体可传递HCV蛋白至HSC并激活HSC，诱导肝纤维化发生。本项目将通过HCV感染肝实质细胞、HCV感染肝实质细胞源外泌体与HSC的共培养，检测HSC炎症因子（TNF-α、IL-1β等）与激活标记（α-SMA等）的表达；并将表达HCV蛋白的肝实质细胞源外泌体处理HSC来探讨不同HCV蛋白的致肝纤维化作用；最后通过阻断炎症信号通路（NF-κB、JNK）的激活来阐明相关机制，为揭示HCV的直接致肝纤维化作用提供重要的理论和实验依据。

丙型肝炎病毒（HCV）感染是全球重要的公共卫生问题，HCV是引发慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌的主要病原。HCV与宿主免疫系统之间复杂的相互作用决定HCV感染的临床表现和肝脏损伤程度。尽管HCV急性和慢性感染都会引发宿主的细胞和体液免疫反应，但是这些免疫反应大多数情况下并不能有效的清除病毒，导致大部分的HCV感染进展为持续的慢性感染。已有研究表明慢性HCV感染是导致肝纤维化发生的主要病因之一，肝星状细胞（Hepatic stellate cells, HSC）是介导肝纤维化发生的首要细胞。我们的研究结果证实HCV感染的肝细胞（JFH-1-Huh7）可直接激活人HSC细胞系LX-2和原代HSC细胞，在共培养的情况下上调HSC中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1与趋化因子MCP-1、和RANTES的表达，以及HSC中α-SMA的表达。在外泌体的机制研究方面，由于外泌体纯化的得率低，尚未得到可靠的实验数据。因此，我们对该项目的部分研究内容进行调整，重点研究了茶多酚（EGCG）调节细胞先天免疫抑制HCV的作用与机制，证实了EGCG可调节poly I:C激活的肝实质细胞TLR3信号通路，上调poly I:C诱导的TLR3、RIG-I、干扰素-lambda 1、干扰素刺激因子（ISG15、ISG56、MxA和OAS-1）的表达，并可协同poly I:C抑制HCV在肝实质细胞中的复制。本项目的研究工作在体外细胞水平证实了HCV感染的肝实质细胞可以直接激活HSC细胞，为今后进一步深入研究HCV的致病机制提供线索。此外，我们的研究发现EGCG可增强poly I:C诱导的肝实质细胞先天免疫反应，并且可协同poly I:C抑制HCV在肝实质细胞中的复制，为揭示EGCG的抗病毒功能和潜在的临床应用提供实验依据。