长期吸烟抑制Nrf2诱导衰老在肺血管重塑中的作用

Pulmonary vascular remodeling(PVR) is a basic pathological change of pulmonary hypertension,which is a independent risk factor for the course and the prognosis in chronic obstructive pulmonary disease(COPD), and the mechanisms for the development of PVR is still unclear. Chronic cigarette smoke is the main cause of COPD. In healthy smokers, key factor protecting against oxidative stress injury is nuclear factor erythroid 2-related factor-2(Nrf2), a nuclear factor regulating the expression of a series of key antioxidant genes. The level and the function of Nrf2 is decreased obviously in patients with COPD. The cigarette smoking may directly affect the pulmonary vessels and result in PVR possibly through inhibiting Nrf2. The recent studies suggested that COPD was a senescence-related disease, PVR could be classified as a senescence-related pathological change. The senescent pulmonary vascular cells maybe acquire senescence-associated secretory phenotype(SASP), and stimulate the peripheral pulmonary arterial smooth muscle cells to proliferate and produce extracellular matrix by way of paracrine, which could result in PVR. Recent studies confirmed that Nrf2 played important roles in protecting against the oxidative stress injury leading to blood vessel senescence. The applicant supposed that chronic cigarette smoke could induce senescence and SASP by inhibiting Nrf2 in pulmonary vascular cells, which contributed to the development of PVR by way of paracrine. This hypothesis will possibly to be a new mechanism for the development of PVR.

肺血管重塑（PVR）是肺动脉高压的基本病理学改变，是影响慢性阻塞性肺病（COPD）病程和预后的独立危险因素，其形成机制仍不清楚。长期吸烟是COPD最常见原因，健康者对抗吸烟所致氧化应激损伤的关键因子是红系核因子2相关的因子2（Nrf2）-调控一系列主要抗氧化因子基因表达的核转录蛋白。COPD患者Nrf2的水平和功能明显低下，吸烟可能直接作用于肺血管并通过抑制Nrf2引起PVR。最新研究提示COPD是衰老相关性疾病，PVR属于衰老相关性病变，衰老的肺血管细胞可能获得衰老相关的分泌表型（SASP），通过旁分泌方式刺激周围肺动脉平滑肌细胞增生并产生细胞外基质而引起PVR；近来研究证实，Nrf2在对抗氧化应激损伤诱导血管细胞衰老中具有重要作用。申请者假设：长期吸烟可能通过抑制Nrf2的功能诱导肺血管细胞衰老并获得SASP，通过旁分泌方式促使PVR形成。该假设可能成为PVR形成的新机制。

项目背景：肺血管重塑（PVR）是慢性阻塞性肺病（COPD）重要的病理形态学改变。长期吸烟可诱发COPD。已知红系核因子2相关因子2（Nrf2）是体内重要的抗氧化应激和衰老的调控蛋白，在吸烟所引起的衰老及氧化应激过程中扮演重要的角色。本研究从Nrf2拮抗氧化应激和衰老的角度探讨长期吸烟诱发PVR过程中Nrf2的表达变化，及其调控的衰老相关蛋白和衰老相关的分泌表型（SASP）的变化，阐明长期吸烟诱发的PVR是一个典型的衰老过程。.研究内容：在离体实验部分，利用香烟提取物（CSE）处理肺血管内皮细胞（HPAEC）。应用western blot和 RT qPCR 检测衰老相关标记物（P21,P53）表达；应用flow-fish检测端粒酶长度的变化；同时检测Nrf2及衰老相关的分泌表型（SASP） 的表达改变。检测抗氧化应激和衰老的因子Nrf2及其下游调节因子HQ-1和NQO1的表达改变。应用β-半乳糖苷酶染色和免疫荧光染色分别标记衰老细胞的累计和Nrf2的表达定位。.利用siRNA和激动剂干预检测nrf2对各观察指标的影响。利用含有SASP的条件培养基培养肺血管平滑肌细胞（HPVSMC），观察HPVSMC的增殖迁移活性。建立吸烟大鼠肺血管重塑PVR动物模型，观察Nrf2及衰老相关因子的表达变化。.实验结果：CSE持续刺激的HPAEC发生明显的衰老改变，衰老标记物（P53,P21）表达增高，衰老相关的分泌表型（SASP）表达显著升高；而端粒酶长度显著缩短；Nrf2及其效应因子表达明显下降。应用Nrf2激动剂 tBHQ及Nrf2 pcDNA3.1 转染HPAEC，可有效地削弱CSE刺激所引起的HPAEC衰老改变。si-Nrf2可引起HPAEC中Nrf2的耗竭，从而促进CSE刺激所致的HPAEC衰老改变。含有SASP的条件培养基能够刺激HPVSMC的迁移和增殖活性，促进PVR的形成。.实验结论及科学意义：长期吸烟所引起的肺血管重塑（PVR）是一个典型的衰老变化。Nrf2是CSE刺激所致的PVR中一个重要的拮抗氧化应激和衰老的调节因子，未来可作为COPD防治的一个新的实验依据。本研究首次提出长期吸烟所致的PVR是一种细胞衰老过程，并阐明Nrf2在这一过程中的重要调节作用，为COPD的防治提供新的治疗靶点。