基于表面引发原子转移自由基聚合技术的超长超细内径毛细管开管柱的制备及其在蛋白质组分析中的应用

Proteomics is challenged by the complexity of samples. Therefore, it is urgent to develop high-resolution and high-sensitivity analytical techniques. For nano-liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry (nanoLC-ESI-MS), which is widely used in proteomic analysis, long narrow-bore separation capillary column technique is promising to improve the resolution and sensitivity for low abundance protein analysis. Based on the different stationary phases, the separation columns can be classified as packed columns, monolithic columns and open-tubular columns. Compared with the other two kinds of columns, open-tubular columns are suitable for the preparation of long narrow-bore separation capillary columns, with advantages of facile preparation and very low back pressure. However, such columns suffer from the low surface area and poor preparation controllability. In this project, long narrow-bore open-tubular capillary columns will be prepared by surface initiated atom transfer radical polymerization (ATRP). The prepared stationary phases would be controlled/living polymer brushes, with advantages of designed structure, large surface area and excellent uniformity, beneficial to improve the separation efficiency and preparation controllability. Furthermore, such columns will be used as separation columns to establish nanoLC-ESI-MS systems for the ultrasensitive analysis of trace proteins in complex samples. Such project is expected to solve the bottleneck problems of proteome analysis especially low-abundance proteins analysis, and provide novel technical support to improve the qualitative and quantitative analytical capacity for proteomic study.

蛋白质组学研究面临的巨大挑战来自样品的复杂性，因此亟需发展高分辨和高灵敏度的分离分析新技术。超长超细内径毛细管分离柱能够显著提高目前蛋白质组分离鉴定的主流技术即纳升级液相色谱-电喷雾质谱联用技术的分辨率和灵敏度。与填充柱和整体柱相比，开管柱具有制备简单、反压低等优点，非常适合用于制备超长超细内径毛细管分离柱。然而开管柱的固定相比表面积小、制备可控性差，因此急需发展新型开管柱制备技术。本项目旨在采用表面引发原子转移自由基聚合技术，制备以结构可控、比表面积大、均一性好的聚合物刷为固定相的超长超细内径毛细管开管柱，进而提高分离柱效和制备可控性；在此基础上，构建纳升级液相色谱-电喷雾质谱系统，实现复杂体系中痕量蛋白质的超高效分离和超高灵敏度鉴定。通过本项目的研究，有望解决目前蛋白质组分析尤其是低丰度蛋白质分析面临的瓶颈问题，为提高蛋白质组的定性和定量分析能力提供技术支撑。

蛋白质组学研究面临的巨大挑战来自样品的复杂性，且某些有价值的样品含量极低，因此亟需发展高分辨和高灵敏度的液质联用(LC-MS)技术。超长超细内径毛细管开管柱与质谱的联用能够显著提高分析灵敏度。然而开管柱普遍存在比表面积小、制备可控性差的问题。本项目基于表面引发原子转移自由基聚合（ATRP）技术制备了以聚合物刷层为固定相的超长超细内径毛细管开管柱。与采用其它方法制备的开管柱相比，具有以下优势：(1)聚合物刷涂层由密集的、弹性的聚合物长链组成，比表面积大，空间位阻小，传质速度快，更有利于痕量样品的分离；(2)涂层厚度与反应时间呈线性关系，因此可以通过控制反应时间来控制涂层的厚度；(3)聚合物链的分子量分布窄，因此涂层厚度的均一性好。在此基础上，发展了喷雾稳定的一体式镀金电喷针作为液质联用接口，并研制了一系列高效低残留整体柱作为捕集柱，构建了超低流速下纳升级液相色谱-电喷雾质谱系统用于痕量样品分析。对仅为60 amol的BSA酶解产物进行分析，BSA的序列覆盖率高达69%。对10 ng Hela细胞酶解产物(相当于100个细胞)进行分析，50 min内单次鉴定~1000个蛋白质，三次共鉴定1327个蛋白质，3035条匹配肽段。痕量蛋白质样品的高灵敏度鉴定主要归功于：(1) 采用了基于ATRP反应的聚合物刷涂层毛细管开管柱，提高了分离效率；（2）采用了与开管柱匹配的低残留杂化整体柱作为捕集柱；(3) 采用了一体式镀金电喷雾针，提供了稳定的电喷雾，并减小了柱后死体积，从而减小了样品峰扩散，提高了鉴定灵敏度。这些结果表明，本项目有望解决切片组织、活检样品、CTC细胞等痕量样品蛋白质组分析面临的瓶颈问题，为提高蛋白质组的定性和定量分析能力提供技术支撑。