基于有机桥联硅氧烷的杂化整体柱制备及其在蛋白质组定性定量分析中的应用

Proteomics is challenged by the complexity of samples. Therefore, the improvement of separation performance by developing stationary phases with high efficiency, low carryover, good stability, plays an important role in qualitative and quantitative analysis with high accuracy, high sensitivity and in-depth profiling. Monoliths have been honored as “the forth stationary phases”, among which, the organic-silica hybrid monolith with the combined advantages of the polymer and silica monoliths has been attracted great attentions in recent years. However, the traditional hybrid monolith meets some challenges, such as non-uniform mesoporous structure, non-specific adsorption caused from Si–OH, limited chemical stability of Si-O-Si framework, and so on. In this project, the organic bridged-bonded alkoxysilane precursors will be applied to prepare bridged hybrid monoliths with uniform and controlled pore structure, large surface area and stable Si-R-Si framework, and the separation performance can be further improved and non-specific adsorption reduced via the organic groups in the framework. Furthermore, such bridged hybrid monoliths will be used as separation columns, combined with MS identification and quantitative technique, to achieve in-depth proteomic profiling of cancer cells and accurate quantitative analysis during their epithelial mesenchymal transition (EMT), providing important technical supports to reveal the metastatic mechanism of tumor.

蛋白质组学研究面临的巨大挑战来自样品的复杂性，因此通过发展高效、低残留、稳定性好的色谱固定相以提高色谱分离能力，对实现高准确度、高灵敏度和深度覆盖的定性定量分析至关重要。整体柱被誉为“第四代色谱固定相”，其中有机无机杂化整体柱兼备有机聚合物整体柱和硅胶整体柱的优点，已成为色谱固定相的重要研究方向之一。但传统杂化整体柱存在介孔孔径不均一、残留硅羟基导致非特异性吸附、骨架Si-O-Si化学稳定性有待提高等问题。本项目旨在采用新型硅烷化试剂-有机桥联硅氧烷作为前驱体，制备孔径均一可控、比表面积大、稳定性好、骨架为Si-R-Si结构的桥联杂化整体柱，并通过骨架中富含的有机基团进一步提高分离能力，降低非特异性吸附。在此基础上，将其作为分离柱，结合液质联用技术及定量技术，实现上皮细胞间质转化（EMT）过程中蛋白质组的深度覆盖定性分析及相对定量分析，为生物学家揭示肿瘤细胞转移机制提供重要技术支撑。

蛋白质组学研究面临的巨大挑战是生物样品极其复杂，因此发展高效、低残留、稳定性好的色谱固定相以提高色谱分离能力，对实现深度覆盖的精准定性定量分析至关重要。本项目基于有机桥联硅氧烷的溶胶凝胶反应，制备了一系列性能优越的新型桥联杂化整体柱用于蛋白质和肽段的分离，并与质谱联用实现了复杂样品蛋白质组定性定量分析。制备了孔径均一可调、稳定性好的C18功能化乙基桥联杂化整体柱，使标准肽段分离的平均半峰宽为0.09min，柱内和柱间的肽段保留时间的RSD值小于2.5%。制备了孔壁及孔道中皆富含双键的桥联杂化整体柱(VTMS-BTSEY)，其C18键合密度高达5.54µmol·m-2，从而实现了肽段的高分辨分离及规模化鉴定，Hela细胞酶解肽段分离的峰容量高达482(梯度为6h)，鉴定数目高于文献报道水平。制备了C18功能化的仲氨基桥联杂化整体柱，减少了硅羟基的非特异性吸附，从而减小了肽段在质谱兼容条件下分离的半峰宽，其与高分辨质谱联用，实现了痕量样品酶解产物的高灵敏度分析。制备了C1功能化、介孔孔径为24nm的乙烯基桥联杂化整体柱，用于完整蛋白质的分离，使E.coli蛋白质分离的峰容量高达488(梯度为240min)。制备了C8功能化的仲氨基桥联杂化整体柱，40min分离梯度内蛋白质的峰容量高达377。制备了C8功能化乙烯基桥联杂化整体柱用于蛋白质的高分辨分离，其与maXisII Q-TOF质谱联用，实现了微量心脏样品中完整蛋白质的分离鉴定。最后，选用C18@VTMS-BTSEY超长毛细管整体柱与Orbitrap Fusion Lumos质谱联用，实现了上皮细胞间质转化(EMT)过程中蛋白质组的定性定量分析，其中定量到3136个蛋白质，为揭示肿瘤细胞转移机制提供了重要技术支撑。以上结果充分显示本项目研制的桥联杂化整体柱在蛋白质组学精准定性定量分析中的应用前景。