幽门螺杆菌通过AKT信号通路调控miR-135b-5p/FOXO1在胃癌细胞凋亡中的功能机制研究

miRNA plays important roles in the carcinogenesis of different cancers. The helicobacter pylori (H. pylori) infection is the I carcinogen of gastric cancer which exerts vital roles in the carcinogenesis of gastric cancer through regulating microRNA(miRNA) expression. Our previous study showed Hp up-regulates miR-135b-5p expression to affect cell proliferation and apoptosis in gastric cancer. In this study, we aim to infect different gastric epithelial cells (including normal, gastritis, low-grade dysplasia, high-grade dysplasia and gastric cancer cells) with H. pylori and explore miR-135b-5p expression and Akt activation. Our result would indicate that miR-135b-5p expression is correlated with different pathological stages and could target FOXO1 to downregulate its protein expression. Also, we could get the same result when infect C57BL/6 mice with H. pylori. Using organoid to with different pathological stages to investigate cell apoptosis in C57BL/6 mice. This study could provide a new method to indicate early gastric cancer in patients infected with H. pylori.

miRNA广泛参与肿瘤的病理生理过程，我们的前期研究发现了一系列在胃癌中表达失调的miRNA，探讨其在胃癌中的功能机制具有重要意义。幽门螺杆菌感染是胃癌发生的I类致癌原，通过调控miRNA表达进而调控胃癌的发生发展。我们提出Hp调控miR-135b-5p参与胃癌的细胞增殖及细胞凋亡过程。本研究拟将幽门螺杆菌感染不同病理阶段胃上皮细胞，探究miR-135b-5p表达及AKT信号通路激活；miR-135b-5p再通过靶向性下调FOXO1表达，调控胃上皮细胞的细胞凋亡过程；并通过感染C57BL/6小鼠，探究不同病理阶段胃上皮中miR-135b-5p表达；同时取不同病理阶段胃上皮细胞的进行3D培养及3D培养细胞接种C57BL/6小鼠探究细胞凋亡的调控，最后初步阐明幽门螺杆菌感染通过AKT/miR-135b-5p/FOXO1参与不同阶段的胃癌发生过程。

胃癌占世界上肿瘤相关死亡原因的第三位，幽门螺杆菌（Hp）感染是导致胃癌的重要危险因素之一，《幽门螺杆菌胃炎京都全球共识》认为Hp阳性者应当行全民根除治疗，以降低胃癌发病率。然而，Hp感染到胃癌的发生是一个复杂的病理生理过程,经历了慢性胃炎、肠化、低级别瘤变、高级别瘤变、原位癌及胃癌等过程；在庞大的感染人群中，只有5%发展为胃癌的癌前病变，其中10%则继续进展为胃癌。因此，亟需寻找Hp感染至发展为胃癌过程中重要的中间分子标志物，缩小需要Hp根除人群的范围。本研究在前期研究基础上，通过ISH检测更直观的表明miR-135b-5p在胃癌组织中表达上调，同时，充分挖掘公共数据库信息，再次证实了miR-135b-5p在胃癌组织中是表达上调的，且miR-135b-5p对于胃癌的病理分期及临床预后具有重要意义。运用MTS assay和EDU imaging assay方法，通过过表达及敲低miR-135b-5p，发现miR-135b-5p过表达时促进胃癌细胞的细胞增殖。运用流式细胞学检测方法，通过过表达及敲低miR-135b-5p，发现miR-135b-5p过表达时抑制细胞凋亡。检索三个miRNA靶基因预测数据库（miRStarBase, miRTarBase and miRDIP），得到重复基因，发现A可能是miR-135b-5p的靶基因。当miR-135b-5p过表达或敲低时，A均出现蛋白水平的表达下调或上调，提示A可能是miR-135b-5p的靶基因。同时构建A的野生型和突变型luciferase reporter,在胃癌细胞AGS和HGC27中转染，证实了A是miR-135b-5p的靶基因（具体结果见附件）。我们采用挽救实验的方法，证实了miR-135b-5p促进胃癌细胞增殖和抑制细胞凋亡是通过调控靶基因A表达实现的。通过检索公共数据库及采用免疫组化的方法对A在胃癌中表达进行了探究，发现A在胃癌中表达下调，并且A的高表达预示着胃癌的整体生存期及无病生存期更长。基于Hp引起的慢性炎症及炎癌信号通过在肿瘤发生中的重要作用，本研究对于幽门螺杆菌感染后对miR-135b-5p的调控进行了分析，发现Hp感染可以上调miR-135b-5p表达，并且与炎症信号通路相关（具体结果见附件）。因此，本研究发现HP通过炎症信号通路介导了miR-135b-5p/靶基因A促进胃癌的细胞增殖的作用。