S-亚硝基谷胱甘肽还原酶在番茄应答硝酸盐胁迫中的作用机制研究

Soil secondary salinization caused by nitrate accumulation is a major factor limiting the greenhouse vegetable production. According to the microarray data of tomato root under nitrate stress, we speculated that S-nitrosoglutathione reductase (SlGSNOR) might play important roles in reponse to nitrate stress.We hypothesized that SlGSNOR might function by removing excess SNOs or by regulating the redox state through S-nitrosylation. Based on this hypothesis, we will analyze the expression of SlGSNOR and the metabolism of NO to investigate the mechanism of SlGSNOR using tomato plants as material, by adding NO donor, NO scavenger and GSNOR suppressor. Besides,we will analyze the key enzyme acitivites of the ascorbate-glutathione cycle and their S-nitrosylation state, and identify the target proteins which is S-nitrosylated, to reaveal the mechanism of SlGSNOR with the redox state. At last, we will use SlGSNOR over expression and RNAi transgenic tomato plants to validate the the function and mechanism of SlGSNOR. The project will be helpful for us to further understand the mechanism of vegetable under secondary salinization and provide novel strategy and gene resourse for vegetable molecular breeding to enhance resisitance to stress.

NO3-积累造成的次生盐渍化是设施蔬菜生产的主要障碍因子。前期的芯片结果表明S-亚硝基谷胱甘肽还原酶（SlGSNOR）在NO3-胁迫应答中可能发挥重要作用，推测其作用机制可能与S-亚硝基硫醇（SNOs）的清除及S-亚硝基化调控的体内氧化还原状态有关。在此基础上，本项目拟以番茄为材料，结合NO供体、清除剂和GSNOR抑制剂，分析SlGSNOR的表达、NO代谢关键产物的含量，明确SlGSNOR的作用机制与SNOs的关系；分析抗坏血酸（AsA）-谷胱甘肽（GSH）循环关键酶的酶活性变化及是否发生S-亚硝基化、AsA和GSH含量变化，鉴定S-亚硝基化的靶蛋白，揭示SlGSNOR的作用机制与氧化还原状态的关系。最后，利用过量表达和RNAi抑制表达的SlGSNOR转基因番茄植株进一步验证这个作用机制。本项目的实施将加深我们对蔬菜应答次生盐渍化机制的认识，同时为蔬菜抗逆遗传改良提供新的基因资源和策略。

硝酸盐胁迫下，番茄幼苗中H2O2和MDA含量、ROS荧光含量以及NO和SNOs含量增加。外源施加适量的NO供体（SNP和GSNO）可以降低H2O2，MDA和ROS含量，增加抗氧化物酶SOD、POD、CAT、APX、GR活性、ASA和GSH含量，并且增加SlGSNOR的表达水平，降低NO和SNOs含量。硝酸盐处理后，番茄叶片和根系S-亚硝基化水平增加，外源施加100 µM SNP后番茄叶片和根系S-亚硝基化水平稍有降低。通过MALDI-TOF鉴定，在根和叶中分别有10和6条发生S-亚硝基化的蛋白被鉴定出来，包括代谢相关的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1、二磷酸核酮糖羧化酶大亚基、放氧复合体增强子蛋白、乌头酸水合酶、蔗糖合成酶、腺苷高半胱氨酸酶、S-腺苷甲硫氨酸合酶、磷酸甘油酸酯激酶、膜联蛋白；蛋白质合成相关的蛋白，如肽酰脯胺酸顺反异构酶、延伸因子和未知蛋白。Western blot检测表明MDHAR 在硝酸盐胁迫后和施加SNP后S-亚硝基化水平增加。通过的原核表达和Ni2+-NTA 亲和柱纯化获得SlAPX的可溶性蛋白，用GSNO处理后，APX蛋白的活性增加，表明S-亚硝基化增加了APX的酶活性。将构建好的SlGSNOR的过表达和RNAi抑制表达载体转化番茄获得相应的转基因番茄植株。硝酸盐胁迫下SlGSNOR的RNAi抑制植株的种子发芽率低于野生型（WT）。对转基因番茄幼苗浇硝酸盐溶液处理后，过表达植株的生长好于野生型植株，组织化学染色显示H2O2，O2-含量及ROS荧光含量低于WT；而RNAi植株的生长差于WT，其H2O2，O2-和ROS荧光含量高于WT。此外我们获得了SlGSNOR和SlAPX、SlMDHAR和SlGR的过表达转基因烟草，并且在添加硝酸盐的MS培养基中，这些过表达转基因烟草种子的发芽率高于WT。