硫氧还蛋白（SlTrx）在番茄应答硝酸盐胁迫中的作用机制研究

Soil secondary salinization caused by nitrate accumulation is a major factor limiting the greenhouse vegetable production. According to the microarray data of tomato root under nitrate stress and yeast two hybrid, we speculated that thioredoxin (SlTrx) might play important roles in response to nitrate stress.We hypothesized that SlTrx might function through S-nitrosylation and denitrosylation. Based on this hypothesis, we will analyze the expression of SlTrx and the metabolism of NO to investigate the interplay of SlTrx and NO using tomato plants as material, by adding NO donor, NO scavenger, GSNOR and thioredoxin reductase inhibitor. Besides,we will analyze S-nitrosylation of SlTrx and the putative cysteine in SlTrx.Then we will analyze the denitrosylation of SlTrx by analyzing the SNO reductase activity of SlTrx and identify the target proteins which is denitrosylated by SlTrx to reveal the mechanism of SlTrx in response to nitrate stress. At last, we will use SlTrx over expression and RNAi transgenic tomato plants to validate the function and mechanism of SlTrx. The project will be helpful for us to further understand the mechanism of vegetable under secondary salinization and provide novel strategy and gene resourse for vegetable molecular breeding to enhance resistance to stress.

硝酸盐积累造成的土壤次生盐渍化是设施蔬菜生产的主要障碍因子。前期的芯片和酵母双杂交试验表明硫氧还蛋白（SlTrx）在硝酸盐胁迫应答中可能发挥重要作用，推测其作用机制可能是通过发生S-亚硝基化并对靶蛋白进行去亚硝基化参与硝酸盐胁迫应答。在此基础上，本项目拟以番茄为材料，施加NO供体、S-亚硝基谷胱甘肽还原酶抑制剂和Trx还原酶抑制剂，探讨SlTrx和NO的相互调控关系；分析SlTrx的S-亚硝基化及其可能的半胱氨酸位点，明确硝酸盐胁迫下SlTrx的作用是否与其发生S-亚硝基化有关；通过分析SlTrx的去亚硝基化作用，并筛选其靶蛋白，揭示SlTrx的作用是否与其对靶蛋白的去亚硝基化有关；最后，利用过量表达和RNAi抑制表达的SlTrx转基因番茄植株进一步验证这个作用机制。本项目的实施将有助于丰富我们对蔬菜应答次生盐渍化的机制的认识，同时为蔬菜抗逆遗传改良提供新的基因资源和策略。

硝酸盐（NO3-）积累造成的土壤次生盐渍化是设施蔬菜生产的主要障碍因子。外源施加一氧化氮（NO）供体SNP可以降低过量NO3-对番茄生长的抑制、活性氧（ROS）、NO、丙二醛（MDA）含量，增加抗氧化物酶（SOD，CAT，POD）活性。NO3-胁迫下番茄中硫氧还蛋白（SlTrxh）的表达增加,施加NO增加SlTrxh基因的表达，S-亚硝基化蛋白和SlTrxh的S-亚硝基化。体外SlTrxh蛋白可以发生S-亚硝基化，而Cys54突变为Ser的SlTrxC54S蛋白的S-亚硝基化水平下降，并且其胰岛素还原活性降低。SlTrxh和NRTB可以使S-亚硝基化的BSA、S-亚硝基化的植物蛋白去亚硝基化，而SlTrxhC54S蛋白去亚硝基化水平下降。SlTrxh定位于细胞质、细胞核和质膜中。酵母双杂交、pull down和Co-IP实验证明SlTrxh与SlPrx,SlTFT5和SlGSNOR蛋白互作。荧光素酶实验和凝胶阻滞实验表明SlMYB86结合SlTrxh启动子并激活其表达。为了进一步研究SlTrxh的功能，获得了SlTrxh过表达和RNAi的转基因番茄。SlTrxh过表达的转基因番茄叶片在过量NO3-处理下叶绿素含量比野生型（WT）高。NO3-处理后，与WT相比，RNAi的转基因番茄株高和鲜重低于WT，ROS，MDA，H2O2，O2-含量高于WT，抗氧化物酶SOD，CAT，POD，APX的酶活性以及SlSOD，SlPOD，SlCAT，SlAPX，SlMDHAR的表达，NO荧光和SNO含量，SlNR，SlGSNOR的表达低于WT。RNAi番茄中SlTrxh的S-亚硝基化低于WT，NO3-胁迫后SlTrxh的S-亚硝基化增加，但RNAi株系的水平低于WT。我们还在转基因烟草中验证了SlTrxh的功能，NO3-胁迫后SlTrxh过表达烟草的种子发芽率、鲜重、根长显著高于WT，H2O2，O2-含量低于WT；而SlTrxhC54S转基因烟草的结果与此相反。NO3-胁迫后SlTrxh过表达株系长势好于WT。此外，MV处理后，SlTrxh过表达株系的种子存活率高于WT，幼苗的生长好于WT。我们的研究表明SlTrxh在NO3-胁迫下调控ROS的平衡，并且其Cys54对其发生S-硝基化、去亚硝基化活性和酶活性非常重要。