NO3-胁迫下菠菜血红蛋白(SoHb)的功能及作用机理研究

NO3-积累造成的次生盐渍化是设施蔬菜生产的主要障碍因子，根据前期 NO3-胁迫下菠菜抑制消减杂交文库的结果推测菠菜血红蛋白(SoHb)在NO3-胁迫应答中可能发挥重要作用，其作用机理可能与菠菜体内NO代谢的水平有关。在此基础上，本项目以菠菜为材料，研究NO3-胁迫下抗性不同的菠菜中SoHb的表达与NO含量、硝酸还原酶(NR)的关系，并通过外源施加NO供体、NO清除剂、NR抑制剂探讨SoHb在NO3-胁迫下可能的功能及作用机理；明确SoHb蛋白在体外和体内与NO能否直接作用；利用SoHb过表达和RNAi抑制表达的转基因拟南芥植株进一步验证SoHb的功能及作用机理，寻找可能的下游调控基因，阐明SoHb调控菠菜适应NO3-胁迫的机理，为改良根际环境，减轻土壤次生盐渍化危害奠定理论基础，同时为蔬菜抗逆遗传改良提供理论依据。

本项目以菠菜抗性品种（‘超级菠菜’）和盐敏感品种（‘大叶菠菜’）为材料，通过外源施加NO供体、NO清除剂、硝酸还原酶（NR）活性抑制剂，研究了硝酸盐胁迫下SoHb的表达特性与NO含量、NR的关系，并利用SoHb过表达转基因拟南芥验证了SoHb的作用机理。主要结果如下：（1）抗性不同的菠菜品种中，SoHb对硝酸盐胁迫的应答不同，并且与NO代谢有关。（2）构建SoHb过表达载体pK2GW7-35S-SoHb，并转化拟南芥，获得了SoHb的过表达植株。与WT相比，过表达转基因株系根中NO含量降低，植株开花提前。硝酸盐胁迫后发现，过表达拟南芥植株长势差，其Fv/Fm，SOD，CAT和APX活性低于WT, MDA含量高于WT。P5CS1、CAT1、MnSODmi、RD29A、RD29B、RD22、COR47等胁迫应答基因的表达均发生变化，表明过表达SoHb降低了植株的硝酸盐胁迫抗性。（3）构建原核表达载体PET32a-SoHb，经Ni2+ NTA亲和柱纯化，获得纯化的融合蛋白。与空载体相比，重组菌对硝化胁迫的抗性增加。以纯化的融合蛋白为抗原免疫昆明小鼠，制备了多克隆抗体。（4）过量的SNP抑制了WT和SoHb过表达植株的生长，但与WT相比，转基因植株的鲜重和根长高于WT，表明SoHb过量表达提高了植株的硝化胁迫抗性。本课题的实验结果表明SoHb可能通过清除NO来参与硝酸盐胁迫。