过量ox-LDL引起巨噬细胞自噬阻隔反转底物蛋白p62的功能致动脉粥样硬化斑块不稳定

High fat diet is a risk factor for atherosclerosis (AS), which can cause the disorder of lipid metabolism and inflammatory response, but the mechanism has not been fully clarified. Our previous study found that high concentrations of ox-LDL can induce autophagy and substrate protein p62 accumulation in macrophages, while p62 knockdown can reduce apoptosis and inflammatory cytokines IL-18, MMP9 levels. However, some studies have shown that p62 knockout resulted in promoting AS. So we found that different states of autophagy regulated the effect of p62 to promote/oppose AS. Therefore, we propose that the block of autophagy induced by excess of ox-LDL reverses the substrate protein p62 function to make atherosclerotic plaque instability. In this study, we use ox-LDL to induce the formation of different states of autophagy. p62 was used as the breakthrough point to illuminate its effect on the inflammatory response, cell apoptosis and the molecular mechanism. To demonstrate the role of autophagy inducer in AS and verify it in the animal model. Through the phenomenon - molecular mechanism - animal model, we explore the relationship between p62 and AS, the molecular mechanism of it and the system of the effect of autophagy inducer dose on AS. The study will provide a new target for clinical prevention and treatment of AS.

高脂饮食是动脉粥样硬化（AS）的危险因素，可以引起脂代谢紊乱和炎症反应，但具体机制尚未完全阐明。我们前期研究发现高浓度ox-LDL可引起巨噬细胞自噬阻隔和底物蛋白p62蓄积，而敲除p62可降低细胞凋亡和炎症因子IL-18、MMP9水平。但有研究发现敲除p62能促进AS斑块进展。由此我们推测不同的自噬状态调控p62的促/抗AS斑块稳定的作用。因此我们提出：过量ox-LDL引起巨噬细胞自噬阻隔反转底物蛋白p62的功能致动脉粥样硬化斑块不稳定。本课题用ox-LDL诱导形成不同自噬状态，以p62为切入点，研究其对AS斑块炎症反应、细胞凋亡的影响以及内在的分子机制。探究自噬诱导剂在AS中的作用，并在动物模型上进行验证。通过现象--分子机制--动物模型三个层面，深入研究p62与AS斑块稳定性的关系及分子机制，并探讨自噬诱导剂剂量对AS斑块稳定性的效应，为临床预防和治疗AS斑块不稳定提供新靶点。

巨噬细胞内脂质累积及凋亡是决定动脉粥样硬化斑块稳定性的重要因素，自噬被认为是影响巨噬细胞脂质累积和凋亡的重要因素，而p62又是自噬过程中的关键分子，但关于p62在其他自噬相关性疾病中的作用仍存在争议，因此本课题就p62如何影响巨噬细胞自噬进而影响AS斑块稳定性的问题进行了深入研究。在此课题中，我们观察到在不同自噬状态下p62具有双重作用，我们以此为基点寻找自噬阻隔状态下p62与自噬调控的诸多表型发生改变的途径，发现p62通过调控细胞脂质代谢与焦亡在维持AS斑块稳定性中发挥了重要作用。另外，我们还探寻了其他可以引起自噬阻隔状态下能够调控细胞状态的因素，如miRNAs。最后得到结果如下：①p62在巨噬细胞源性泡沫细胞形成过程中发挥双重作用，在基础自噬状态下，p62沉默导致自噬功能障碍，p62过表达可促进自噬；巨噬细胞自噬阻隔时，p62沉默可缓解自噬紊乱，p62过表达加重自噬紊乱，进而引起细胞表型改变，促进AS发展；②p62通过作用于mTOR-ULK1通路调控自噬；③小剂量、短期雷帕霉素诱导可稳定斑块，100nmol/L雷帕霉素处理24h效果最显著，而大剂量、长期雷帕霉素作用增加斑块的易损性；④自噬阻隔时p62/mTOR/LXRα信号通路抑制ABCA1和ABCG1介导的胆固醇流出促进泡沫细胞形成；⑤自噬缺陷通过调控p62/Nrf2/ARE促进过量氧化低密度脂蛋白处理的巨噬细胞焦亡；⑥miR-761可以通过mTOR-ULK1通路促进巨噬细胞自噬，发挥抗AS作用；⑦miR-96-5p可以通过抑制下游靶基因叉头框蛋白O1（FOXO1）进而抑制巨噬细胞焦亡，有利于维持AS斑块稳定性；⑧p62敲除可以增加高脂喂养的ApoE基因敲除小鼠斑块稳定性。. 我们的研究主要从细胞及分子水平层面和体内试验层面探索了p62与自噬对AS斑块稳定性的调控作用，从自噬、脂代谢、焦亡、miRNAs等方面探究彼此之间的内在关系，进一步阐明了影响AS斑块稳定性的因素及作用机制，本研究的实验结果将为新的AS斑块稳定性标志物发现奠定基础，并为不稳定斑块的治疗提供新靶点。