HIF-1α对动脉粥样硬化斑块巨噬细胞自噬作用及生物学效应的影响

Autophagy is a physiological cell repair process. Our previous studies demonstrated that there was a hypoxia microenvironment in the atherosclerosis plaques, and we further showed that hypoxia caused the expression of HIF-1α, WHICH MIGHT LEAD to the induction of autophagy of macrophages. It has been reported that the inhibition of mTORC1 expression induced autophagy of macrophages, led the formation of foam cells from macrophages, and accelerated the formation of the plague. PPAR-γ, a nuclear receptor, probably plays the role as a downstream signal factor of mTORC1. We hypothesize that HIF-1αinduces the autophagy of macrophages by inhibiting the expression of mTORC1 signals and its down-stream regulator PPAR-γ. Therefore, we plan to overexpress HIF-1α using adenovirus and silence its expression using siRNA in BMDM from apoE-/- mice. By using these strategies, we seek to study the effect of HIF-1αon autophagy, the formation of foam cell in the microenvironment of atherosclerosis. Furthermore, we plan to induce hypoxia in the mice to study the relationship between hypoxia, HIF-1αinduction, mTORC1-PPAR-γsignaling pathway regulation, and the formation of the plague. Eventually, we plan to study the effect of long term oxygen therapy on AS formation using apoE-/- mice with high cholesterol diet as the animal model to develop an economic and effective therapeutic approach for atherosclerosis treatment.

自噬作用是细胞的一种生理性修复现象。我们前期试验证实动脉粥样硬化斑块局部存在缺氧，发现缺氧对巨噬细胞自噬作用的影响有可能与HIF-1α的表达相关。有研究表明mTORC1的抑制可以诱导巨噬细胞自噬作用，对细胞进行保护，并加速其转变成泡沫细胞，是斑块形成的一个重要因素。我们认为HIF-1α是通过抑制mTORC1诱导巨噬细胞自噬作用，PPAR-γ作为重要的核受体，很可能是其下游信号转导途径，因此提出缺氧可能通过HIF-1α- mTORC1-PPAR-γ途径影响巨噬细胞的自噬及生物学效应的假说。本项目拟通过缺氧、转染HIF-1α腺病毒及siRNA干扰，改变细胞内HIF-1α的表达，观察apoE-/-小鼠BMDM自噬作用、迁移及泡沫细胞形成，以发现缺氧、HIF-1α，mTORC1及PPAR-γ与粥样斑块形成之间的内在联系；并探索规则氧疗对高脂饮食喂养apoE-/-小鼠模型动脉粥样硬化斑块形成的影响，

目的：动脉粥样硬化斑块局部存在缺氧现象，而缺氧环境下缺氧诱导因子（HIF-1α）表达增高并起到主要生理调节作用，缺氧对巨噬细胞自噬作用的影响有可能与HIF-1α的表达增高相关。有研究表明mTORC1的抑制可以诱导巨噬细胞的自噬作用，对细胞进行保护，并加速其转变成泡沫细胞，是斑块形成的一个重要因素，所以认为HIF-1α是通过mTORC1来诱导巨噬细胞发生自噬作用，因此本研究主要是缺氧通过HIF-1α/mTORC1途径来影响巨噬细胞的自噬作用。方法：选取小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）进行细胞培养，分别以低氧浓度（3%）和正常氧浓度（21%）干预细胞培养，并用HIF-1α干扰RNA（HIF-1α shRNA）抑制HIF-1α的表达，提取细胞总蛋白后用Western Blot方法检测Beclin-1、Bcl-2、LAMP-1蛋白的表达水平，同时用雷帕霉素干预细胞检测上诉蛋白表达水平，以及缺氧条件下4E-BP1、S6K及其磷酸化蛋白的表达水平，并用免疫荧光法检测LC3、LAMP-1的表达水平，同时运用扫描电镜观察在不同的条件处理下巨噬细胞中自噬小体的数量变化。另在高氧条件下，运用RT-PCR及Western Blot测量ApoE基因缺陷的小鼠主动脉内MMP-9，VEGF和IL-6的mRNA及蛋白表达水平。结果：在缺氧条件下，巨噬细胞中Beclin-1、LAMP-1蛋白的表达水平均增高，而Bcl-2表达水平减低，另外4E-BP1、S6K的磷酸化蛋白表达水平降低，同时观察到LC3、LAMP-1的免疫荧光效果增强，以及扫描电镜下自噬小体数目增多，另外细胞经雷帕霉素干预后，得出的结果与上诉结果相同。但将HIF-1α shRNA转染入细胞之后，上述结果均出现相应性降低。高氧条件可以抑制ApoE基因缺陷的小鼠主动脉内MMP-9，VEGF和IL-6的mRNA及蛋白的表达。结论：缺氧条件下，HIF-1α可以加强巨噬细胞的自噬作用，并且是以经HIF-1α/mTORC1途径来进行调节的，一旦自噬作用效果得到增强后，这种效果就会起到保护细胞在不利条件下生存的作用。因此，缺氧可以诱导巨噬细胞自噬作用的加强，从而加重粥样斑块以及动脉粥样硬化的发展。