RNA干扰对长QT综合征突变基因L539fs/47-hERG沉默效应的研究

Inherited long QT syndrome (LQTS) is an inherited heart disorder characterized by syncope, convulsion or even sudden death. Mutations in hERG can cause type2 LQTS (LQT2). RNA interference (RNAi) is a biological process of post transcriptional gene silencing, by which genes related to diseases can be specially silenced to achieve therapeutic potential. We screened a compound mutation L539fs/47-hERG, which resulted abnormal expression and dysfunction of hERG channels via a dominant-negative suppression effect. In this study, we will design and synthesize 4 small interference RNA (siRNA). Then, we will perform PCR, Western blot and others to screen the siRNA that can sensitively and specifically silence L539fs/47-hERG. Finally, we will conduct laser confocal microscope, Western blot and whole-cell patch clamp to determine the potential of siRNA to rectify the dominant negative suppression effect by L539fs/47-hERG on WT-hERG channels and evaluate the possibility of RNAi-based therapy in LQTS.

遗传性长QT综合征（LQTS）是一种常染色体显性遗传性心脏病，以反复发作的晕厥，抽搐，甚至猝死为临床特征。hERG基因突变与2型LQTS（LQT2）相关。RNA干扰（RNAi）是一种转录后基因沉默现象。RNAi可以特异性沉默某种与疾病相关的基因，发挥治疗潜能。本课题组前期发现一复杂突变基因L539fs/47-hERG，该突变通过负显性抑制作用导致hERG通道表达和功能异常。本研究拟设计合成4条针对L539fs/47-hERG的靶向小干扰RNA（siRNA）序列，然后利用PCR、Western blot等实验筛查出对L539fs/47-hERG具有敏感特异沉默效应的siRNA，最后利用激光共聚焦显微镜、Western blot和膜片钳技术观察筛查出的siRNA能否纠正L539fs/47-hERG对WT-hERG通道的负显性抑制作用，探讨利用RNAi治疗LQTS的可能性。

遗传性长QT综合征（LQTS）是一种常染色体显性遗传性心脏病，以反复发作的晕厥，抽搐，甚至猝死为临床特征。hERG基因突变与2型LQTS（LQT2）相关。RNA干扰（RNAi）是一种转录后基因沉默现象。RNAi可以特异性沉默某种与疾病相关的基因，发挥治疗潜能。本课题组前期发现一复杂突变基因L539fs/47-hERG，该突变通过负显性抑制作用导致hERG通道表达和功能异常。本研究拟探讨能否利用RNAi纠正L539fs/47-hERG对WT-hERG通道的负显性抑制作用，并将RNAi与氨基糖苷类药物对突变通道的纠正潜能进行了对比。本研究针对L539fs/47-hERG设计了4条靶向小干扰RNA（siRNA）序列，利用PCR筛选出敏感性和特异性最高的1条。在膜片钳功能验证部分，在WT-hERG和MT-hERG（WT与MT质粒共转染模拟的杂合体）组分别检测到典型的hERG样电流，但是在MT-hERG+shRNA（WT、MT与shRNA质粒共转染）和MT-hERG+NC-shRNA（WT、MT与NC-shRNA质粒共转染）均未能检测到电流。而在氨基糖苷类药物的干预研究中，全细胞膜片钳结果提示WT-hERG、WT+L539fs/47-hERG在庆大霉素干预下的峰值尾电流增加值分别为10.00pA/pF、14.41pA/pF，增加率分别为18.22%、62.84%。激光共聚焦观察结果提示WT、L539fs/47+WT组在庆大霉素干预后，通道蛋白在胞膜表达均增加，其中L539fs/47+WT组通道蛋白在胞质的滞留得到改善。因此得出结论：siRNA不能改善在异源表达细胞株HEK293细胞上表达的杂合突变通道（WT与MT质粒共转染模拟的杂合体）的功能，这可能与WT、MT与NC-shRNA质粒共转染时，转染效率低下有关。而氨基糖胺类药物庆大霉素可以改善杂合L539fs/47-hERG通道的表达和功能。