热带植物鱼泡草黄酮类抗哮喘活性成分及其作用机理研究

Yupaocao is the whole herb of Jussiaea repens, commonly known as Primrose willow (formerly Ludwigia stolonifera), whicn is among 81 other species belonging to the genus Jussiaea. Yupaocao has been used as a folk herb medicne for asthma treatment in Li nationality since ancient times in Hainan. However, there is not any credible reported study till now, it is thus urgently needed to be confirmed by modern molecular medicine. Our previous works have demonstrated that the ethyl acetate extract isolated from the aerial parts of Jussiaea repens has significant anti-asthma activities, which can effectively inhibite lung inflammation (inflammatory cell infiltration), and significantly down-regulate airway hyperreactivity and IgE level in OVA-induced asthma murine models. Thus, based on these our previous works, in this project, our objective will focus on the flavonoids in the Jussiaea repens. We will isolate and analysis the structures of the isolates using modrn biomedical technique, such as HPLC-UV, HPLC-MS and NMR. Thereafter, we will further established in vitro cell and in vivo murine asthma model to prove whether the new compounds have the anti-asthma capabilities. In additiin, we will use molecular and immunological technique, such as Western blto, ELISA, ELISPOT, to unveil the new compound's possible mechanism. Our study will potentially isolate serval patent drug model molecules or their guide structures, which will contribute to develop and utilize the tropical resource, and potentially offer a new approach for asthma treatment in the future.

鱼泡草是柳叶菜科水生植物水龙(Jussiaea repens)的全草，海南黎族人民长期用于治疗哮喘，文献未见抗哮喘有效成分的报道。我们利用乙酸乙脂提取了鱼泡草黄酮类成分，在小鼠模型中发现可以有效治疗哮喘，明显抑制哮喘小鼠肺部的炎症反应，下调哮喘小鼠的气道反应性和外周血IgE水平。本项目在前期研究基础上，以鱼泡草中的黄酮类化合物为研究对象，运用HPLC-UV、HPLC-MS联用、NMR等现代分离、分析技术对鱼泡草的提取物进行分析检测，可望从中发现新的、活性更强的黄酮类化合物。此后更进一步设计体外细胞实验和体内哮喘动物模型，了解新的化合物是否具有抗哮喘作用。利用分子生物学、免疫学等现代生物医学技术研究其抗哮喘作用的相关机理，为哮喘的防治提供新的、具有自主知识产权的候选药物模型分子或先导结构，为进一步研究与合理开发利用海南热带鱼泡草植物资源提供科学理论依据，同时有可能为哮喘提供新的治疗手段。

海南黎族人民长期用鱼泡草治疗哮喘，我们前期研究发现鱼泡草具有明显的抗哮喘炎症的作用。本项目进一步开展了以下研究并取得了相应的研究结果：①提取、筛选和结构鉴定了20个化合物，其中5个明确为黄酮成分，5个黄酮化合物分别为5,6,7,3′,4′-五甲氧基黄酮（TTF）、5,6,7,4′-四甲氧基黄酮、5-羟基-6,7,3′,4′-四甲氧基黄酮、6-羟基-5,7,4′-三甲氧基黄酮、5-羟基-6,7,3′,4′-四甲氧基黄烷酮；②在体外实验对五个黄酮化合物进行抗炎活性成分的研究，在巨噬细胞中发现大部分具有明显的抑制LPS诱导炎症的作用，机制主要通过抑制NF κB/MAPK信号通路，进而抑制多种前炎症介质的释放；③在OVA诱导的小鼠哮喘模型中发现，五种黄酮化合均具有明显的抗哮喘炎症的作用，本项目重点对TTF进行了研究。在OVA小鼠模型中，发现TTF治疗后，小鼠气道高反应性明显下降，支气管灌洗液中的炎症细胞（包括嗜酸性粒细胞）明显减少，肺组织未见明显的炎症细胞（包括嗜酸性粒细胞）侵润，气管中也没有明显的分泌物，接近正常小鼠肺组织的病理改变；④对涉及哮喘炎症发病的主要介质IgE、组织胺等进行检测。用多种技术方法检测发现TTF治疗可以明显下调外周血IgE的水平，分泌IgE的淋巴细胞数量数量也明显下降，接近于正常组小鼠的水平；用类似的方法检测组织胺的浓度，也发现相似的结果；⑤我们用ELISA和流式细胞术等技术对TTF抗哮喘炎症作用机理进行了研究，发现TTF治疗后Th2细胞因子分泌明显下调，但Th1细胞因子则明显上升，上升水平接近正常小鼠白细胞的分泌水平；在检测外周血白细胞和肺组织侵润淋巴细胞中Treg和Th17细胞数量时发现，TTF治疗后外周血Treg细胞数量明显减少，Th17细胞数量则明显增多并接近正常细胞；流式细胞术检测肺组织中的Th17淋巴细胞的表型，发现TTF治疗后的Th17细胞分泌IL-5的细胞数量明显减少，而分泌IFN-γ的细胞数量明显增加。这些结果说明： 鱼泡草黄酮类化合物，特别是TTF具明显抑制哮喘炎症的治疗作用，其机理通过改善肺组织的免疫微环境，促使哮喘的Th2型免疫反应转变为正常的Th1免疫反应，从而下调IgE、组织胺等免疫炎症介质的水平；也说明鱼泡草黄酮类化合物具有转化应用的前景。