溶酶体途径在pig7基因对急性白血病细胞药物增敏作用中的机制研究

SIMPLE protein eccoded by Pig7 gene has been proved to be one of integral proteins in early endosome/lysosomeearly, and is responsible for the sorting and degradation of intracellular proteins. we revealed a markedly decreased pig7 expression in AL patient group (including relapsed/refractory patients) and AL cell lines (including MDR cell lines), and demonstrated ectopic expression of PIG7 could sensitize leukemia cell lines to chemotherapy medicine, which could then be abrogated by downregulation of PIG7 expression.This study aims to further explore whether that sensitizing effect is associated with intracellular signaling pathways, whether MRP1,Pgp and other ABC systems are involved in this process, whether lysosomal enzymes relaesed by endosome/lysosome where SIMPLE located regulate that process, and whether the intracellular lcalization of SIMPLE protein changes in that regulation? Clarifying the mechanism of sensitizing effect of pig7 in acute leukemia cells may provide a new targeted molecular therapy for leukemia.

Pig7基因编码的SIMPLE蛋白为早期内体/溶酶体膜固有蛋白，目前普遍认为其参与泛素-溶酶体介导的细胞蛋白分选和降解过程。我们前期工作发现在急性白血病患者(包括难治/复发患者)及白血病细胞系(包括耐药株)中该基因表达明显下调，同时证实高表达外源性pig7的白血病细胞(包括耐药株)对药物的敏感性明显增高。本研究旨在进一步探明上述pig7介导的白血病细胞药物增敏作用是否与溶酶体介导的细胞凋亡相关，SIMPLE蛋白是否通过溶酶体途径调控了细胞内凋亡相关信号通路，MRP1、Pgp等ABC系统的是否参与了此增敏过程， SIMPLE蛋白所在的内体/溶酶体是否通过释放溶酶体酶参与调控上述过程，而在此过程中SIMPLE蛋白细胞内定位改变是否具有普遍性，是否作为某种细胞内信号参与调控了溶酶体活性？阐明pig7在逆转白血病耐药和在调节细胞分化凋亡中的作用机制，可以为白血病的靶向治疗提供新的靶向分子。

研究背景：PIG7在白血病细胞中定位于溶酶体膜，我们之前的研究发现使用VP16等药物处理急性白血病患者骨髓有核细胞及白血病细胞系后，在细胞发生凋亡的同时，pig7内源性表达也明显上调，因此我们推测pig7与细胞分化及凋亡有关。我们使用慢病毒将pig7转染一系列白血病细胞后发现大部分的白血病细胞没有发生凋亡，但却发现这些细胞对化疗药物的敏感性明显增加。本研究进一步探讨了pig7介导的溶酶体膜通透性改变在急性白血病细胞増敏过程中的作用机制。.研究内容：我们使用慢病毒将pig7转染至2种急性白血病细胞株、2种急性白血病耐药株（K262/ADM和HL60/ADM）及5例急性白血病原代细胞中。分别检测转染前后不同细胞对化疗药物的增敏效果；检测转染前后细胞溶酶体膜通透性（LMP）、ROS及线粒体膜电势的改变；检测转染前后Caspase 9、Caspase 3及自噬相关基因LC3I/II、ATG5 、Beclin-1的改变；分别检测转染前后溶酶体内及胞浆中（去除溶酶体后）溶酶体蛋白酶Cathepsin B、Cathepsin D、Cathepsin L的改变；检测溶酶体蛋白酶抑制剂、抗氧化剂及Caspase抑制剂对转染后细胞的保护作用；检测pig7在细胞内定位的改变。.重要结果：pig7对白血病细胞的増敏作用和其内源性的pig7表达量有关，本底表达水平越低，其増敏作用越强；高表达pig7不能影响Casapse经典凋亡途径，但对溶酶体膜通透性有明显的负面效应。随着PIG7表达的增强，LMP增强，大量溶酶体蛋白酶(如Cathepsins)释放入胞浆，同时伴随ROS产生增加及线粒体膜电势下降，但此时Caspase凋亡途径并未激活，自噬相关基因表达也未发生改变，细胞内在的保护机制如内源性溶酶体蛋白酶抑制物Spi2A表达增加，使得细胞并不会立即发生凋亡，而处于“濒临凋亡”状态。当在化疗药物的进一步打击下，LMP进一步增强，更多Cathepsins释放激活，加剧ROS产生及线粒体膜电势下降，一旦超出细胞自身保护极限，Caspase非依赖的细胞程序性死亡就会启动，同时Caspase也协同参与了细胞死亡的发生。在此过程中，我们还发现pig7蛋白从溶酶体转移至胞浆中。