口腔白斑及鳞状细胞癌中SMAD4基因失活的机制研究

口腔白斑(OLK)是口腔粘膜中最常见的癌前病变，部分OLK可恶变为口腔鳞状细胞癌(OSCC)。OLK向OSCC的发展呈多阶段、多步骤进行，因此评价OLK恶变潜能并探讨其与OSCC发生发展之间的关系，对OSCC的防治及口腔粘膜癌前病变的化学预防具有非常重要的意义。SMAD4基因是肿瘤抑制基因之一，其失活可使细胞逃脱TGF-β的生长抑制作用而异常增殖，从而诱发癌症。本研究拟采用免疫组化法分析Smad4在口腔正常粘膜、白斑及鳞癌中的表达；建立口腔白斑、鳞癌的实验动物模型，分析其中SMAD4基因和蛋白的表达水平变化；采用PCR测序法、微卫星扫描法分析SMAD4基因突变及杂合性缺失情况；并对Smad4表达水平降低的样本采用特异性甲基化和PCR直接测序法分析其启动子区的甲基化情况。本研究拟揭示SMAD4基因的结构变化和功能状态在口腔白斑癌变进程中的作用，为口腔鳞癌的早期诊断和治疗干预提供新的思路。

本课题分析在白斑向鳞状细胞癌恶性转化的过程中，肿瘤抑制基因SMAD4的失活机制。主要结果如下：.1. 免疫组化法检测Smad4在44例白斑及鳞癌组织中的表达。Smad4在正常口腔黏膜的上皮组织中广泛表达，随上皮异常增生程度增加表达减弱，在口腔鳞癌组织中几乎不表达（Chi square value=7.751，P=0.001）。.2. 采用Realtime-RT PCR及Western Blot在8例白斑及8例鳞癌组织中检测smad4 mRNA及蛋白的表达水平，与正常对照相比，smad4表达水平有显著降低。.3. 采用PCR测序分析，筛查白斑及鳞癌（各11例）中smad4基因突变情况，结果在1例鳞癌中发现突变（c.1239 C>G, p.Tyr413X, 1/22, 4.5%）；白斑组织中未发现smad4基因的突变。.4. 采用基因扫描法对22例白斑及鳞癌中smad4基因位点进行杂合性缺失分析。在16例可提供信息的样本中检测出D18S1110发生杂合性缺失的样本6例（6/16，37.5%），包括白斑重度异常增生 1例，高分化鳞癌1例，中分化鳞癌2例及低分化鳞癌2例。经过统计学分析，白斑（1/8, 12.5%）与鳞癌（5/8, 62.5%）组织之间杂合性缺失的发生率有显著差异（Chi-Square=1.602，P=0.01）。.5. 对13例smad4蛋白表达水平较低的样本进行甲基化PCR测序分析，结果表明：在正常粘膜对照中，SMAD4启动子区域的甲基化水平为4.76%，在口腔白斑中为8.58%，在鳞癌中为15.53%。差异用统计学意义（P=0.03），提示SMAD4基因的启动子区域存在发现过甲基化现象。.综上所述，本研究证实了在口腔白斑及鳞状细胞癌中，SMAD4基因可由于发生基因突变、杂合性缺失及启动子区高甲基化而失活，参与口腔白斑向鳞癌的癌变过程。实验按计划完成，已投稿并修改中SCI论文1篇（Increased regenerative potential of human dental pulp stem cells in PLGA scaffolds via simulated microgravity. Journal of Cellular Physiology, 2014），尚有多篇SCI论文在总结撰写中。