MicroRNAs调控植物受病毒侵染后花叶形成机理的研究

Mosaic disease of plants is one kind of common disease caused by plant viruses. Dark green islands （DGIs）in pathogenetic mosaic leaves are the result of posttranscriptional gene silencing and a phenomenon of recovery and resistance. To date, however, the regulation mechanism of the occurrence of mosaic disease and the formation of DGIs remains elusive. In this proposal, the regulation mechanism of miRNAs on the formation of mosaic disease will be investigated by using two typical mosaic disease systems composed of Cucumber mosaic virus (CMV) and Nicotiana tobacum, Tobacco mosaic virus (TMV) and Nicotiana tobacum respectively, and the following works will be performed：1. To investigate the correlation between miRNAs with mosaic disease by large scale sequence of small RNAs in different tissues of mosaic leaves. 2. To investigate and find miRNAs closely related to the formation of mosaic disease and DGIs through the metabolic substances of DGIs. 3. To investigate the roles of miRNAs in the formation of mosaic disease and DGIs by silencing related miRNAs in tobacco through the techniques of TRV-VIGS, RNAi and over-expression mediated by agrobacterium. The prospective results may provide new data for the machanism study of plant recovery post pathogens’ infection. It may also give some new guidance and strategy on the control of plant viruses in agricultural production.

植物花叶病是一种普遍发生的病毒病害，花叶中深绿色的区域（DGIs）是植物转录后基因沉默的结果，是植物抵抗病毒侵染的一种表现，但其发生、形成及调控的机制尚不明确。本项目拟利用黄瓜花叶病毒（CMV）、烟草花叶病毒（TMV）与烟草构成的两类花叶病互作体系，从以下3个方面研究miRNAs调控植物受病毒侵染后花叶形成的机理：1. 通过全面测定花叶不同组织中的小RNAs，研究miRNAs与花叶病症的相关性；2. 依据花叶中深绿色组织的代谢结果，探查与花叶及DGIs形成密切相关的miRNAs；3. 利用烟草脆裂病毒（TRV）的基因沉默（VIGS）系统以及农杆菌介导的RNA干扰和过表达技术使烟草花叶病相关的miRNAs沉默或过表达，研究miRNAs在调控花叶及DGIs形成中的作用。本项目的研究结果不仅能为植物恢复抗性的作用机理研究提供新的论据，而且有望为农业生产中植物病毒病的防治提供新的理论和实践策略。

植物病害的发生是植物-病原物相互作用的结果。病原物的入侵，会引发寄主植物一系列的防御应答响应。本项目针对非编码小RNA在调控植物受病毒侵染后花叶形成过程中的作用展开研究。利用代表性的特定植物-病毒互作体系为研究对象（分别为烟草与黄瓜花叶病毒-CMV、烟草与烟草花叶病毒-TMV及烟草与辣椒脉斑驳病毒-ChiVMV构成的互作体系），得出了以下重要实验结果：.①病毒侵染可引起寄主植物大量与生长发育、环境应答相关的miRNAs发生改变。病毒侵染中、后期形成的花叶不同组织（DGIs/GVBs及对应的LGTs/ICTs）表达的miRNA与特定组织的防御应答及代谢相关。通过深度测序及分析，筛选出显著相关的miR827、miR6157、miR172、miR1446。②利用农杆菌介导的瞬时过表达、VIGS介导的瞬时沉默，农杆菌介导的过表达、RNAi、CRISPR-Cas9稳定遗传以及系列体内、体外的分子互作研究手段，证实miR827靶向二磷酸果糖磷酸酶（FBPase）正调控DGIs的形成；miR6157靶向RhoGTPase（RHO1）激活蛋白（RhoGAP）负调控烟草的抗病性和DGIs的形成；miR172靶向RHO1解离抑制因子（RhoGDI）负调控烟草的抗病性和DGIs的形成；miR1446则靶向烟草抗逆性的正相关因子RhoGAP结合蛋白（G3BP）负调控烟草的抗病性。③阐明NtRHO1通过与转录因子NtWRKY50相互作用减弱后者对抗病效应蛋白PR1的表达激活而负调控烟草的抗病响应。.综述所述，病毒侵染烟草产生花叶病症过程中，诱导烟草产生免疫响应、引起相关miRNAs的表达水平发生变化进而调控靶基因的表达。除了植物miRNAs 的应答变化，病毒来源的小RNA-vsiRNAs也可能对植物的代谢和症状形成产生影响。就本项目已挖掘到的相关miRNA而言，miR827对FBPase的调控可重调植株功能叶的代谢方向、重置光合同化产物的分配，使受侵染组织有更强的代谢和抗病能力。miR6157、miR172、miR1446的靶基因均涉及到小GTP蛋白酶途径的关键因子，暗示在病毒侵染烟草引起花叶病症过程中，病毒因子和寄主因子围绕小G蛋白途径展开对抗。本项目的研究结果为植物与病毒互作研究引出了一个较为新颖的切入点，为后续的相关研究打下了坚实的基础。