病毒编码的RNA沉默抑制子在远缘植物病毒交互保护中的作用研究

交互保护多发生在亲缘关系相近的同种病毒的不同株系之间，但也能发生在亲缘关系很远的不同病毒之间，目前仍不清楚远缘植物病毒之间发生交互保护的分子作用机制。本项目拟利用黄瓜花叶病毒（CMV）、芜菁皱缩病毒（TCV）与拟南芥构成的交互保护体系进行以下研究：1.利用拟南芥DCL（Dicer-Like）、RDR（RNA-dependent RNA-polymerase）及Argonaute (AGO)系列突变体，研究DCLs、RDRs及AGOs在CMV与TCV交互保护中的作用；2.利用CMV、TCV各自的RNA沉默抑制子的突变体， 研究病毒编码的RNA沉默抑制子在CMV与TCV交互保护中的作用；3.利用酵母双杂交系统和双分子荧光互补（BiFC）技术，研究CMV 2b和TCV P38在体外和植物体内的相互作用。通过上述研究，探明病毒编码的RNA沉默抑制子在远缘植物病毒交互保护中的作用及其分子机制。

交互保护是植物病毒之间以及植物病毒与寄主植物之间相互作用的结果。交互保护通常发生于同一病毒的不同株系或同一病毒属的近缘病毒之间，能显著降低病毒对植物的为害；交互保护也能发生在亲缘关系很远的不同病毒之间，目前仍不清楚远缘病毒之间发生交互保护的作用机制。我们的前期工作表明两种具有经济重要性的远缘病毒-黄瓜花叶病毒（CMV）与芜菁皱缩病毒（TCV）复合侵染拟南芥发生干扰作用。该项目从植物防御病毒侵染的普遍机制-RNA干扰和病毒编码的RNA沉默抑制子入手对CMV、TCV与拟南芥互作系统的交互保护现象进行了研究。. 利用野生型拟南芥Col-0、 C24及RNA沉默途径相关的dcl2/3/4、rdr1/2/6、ago2、ago4及tip突变体，设定单独接种CMV、单独接种TCV、同时接种CMV和TCV（C+T)、先接CMV后以TCV攻毒接种（C-T)、先接TCV后以CMV攻毒接种（T-C)各实验组，观察病症及病程发展，检测病毒的复制和表达。结果表明RNA沉默途径相关因子不能改变TCV对CMV的干扰作用。. 构建了病毒RNA沉默抑制子相关的系列突变体。利用这些突变体克隆以及寄主植物的RNA沉默途径相关突变体，研究了病毒编码的RNA沉默抑制子在CMV与TCV交互保护中的作用。结果表明TCV 编码的RNA沉默抑制子P38在TCV对CMV的干扰作用中起重要作用；此外，RNA沉默机制对病毒沉默抑制子具有抵抗作用并且对非病毒基因序列具有清除作用；同源的突变TCV弱毒株系对强毒的野生型株系具有交互保护作用。.构建了 CMV 2b、TCV P38原核表达载体，表达并制备了相应的抗血清；构建了CMV 2b、TCV P38的酵母双杂交和双分子荧光互补表达载体。通过免疫共沉淀、原生质体侵染及农杆菌注射寄主植物等方法，证明2b和P38在植物体内存在直接作用。构建了CMV 2b及TCV P38的BiFC系列突变表达载体，确认了2b蛋白的 C-端16个氨基酸残基和p38 蛋白的RA及 HP结构域在CMV 2b与TCV p38的相互作用中起至关重要的作用。. 本项目研究证明病毒编码的RNA沉默抑制子的相互作用是远缘病毒TCV对CMV在拟南芥上产生交互保护的重要原因。该研究结果加深了我们对于植物病毒之间的相互作用以及植物抗病分子机制的理解，同时为植物病毒病的防治提供了新的理论依据和实践参考。