荔枝果皮花色苷生物合成MYB负调控因子的筛选与功能验证

Pigment is an important part of the fruit quality in litchi. The red color of litchi pericarp owe to the synthesis and accumulation of anthocyanins. At present, the biosynthetic pathway of anthocyanins have been extensively studied in model plants and horticultural crops. The biosynthetic pathway has been elucidated relative clearly. Transcriptional regulation of anthocyanins is affected by positive regulatory factors and negative regulatory factors. In the past decads, most studies focused on the research of positive regulatory factors. However, studies recently show that negative regulatory factors play an important role in the fine regulation of anthocyanin accumulation for normal plant growth and ensuring correct response to environmental signals. In previous studies, we have investigated the biosynthesis pathway of anthocyanins and its positive regulatory network in litchi. But the research on the negative regulation of anthocyanin biosynthesis in litchi iremains poorly documented. In this study, we will use techniques, such as bioinformatics, space-time expression, subcellular localization, yeast two hybrid, yeast three hybrid, VIGS and heterologous transgene, to screen the MYB negative regulatory factors involving in anthocyanin biosynthesis of litchi, and furthermore verified their function. Hopefully the study will elucidate the molecular mechanism underlying the negative regulation of anthocyanin biosynthesis. The results helps to improve the regulation mechanism of anthocyanin biosynthesis in plants and provide a theoretical basis for the color improvement of litchi fruit.

色泽是荔枝果实品质的重要组成部分，荔枝果皮的红色主要来源于花色苷的合成和积累。目前，花色苷的生物合成途径已在模式植物和园艺作物中进行了广泛研究，其生物合成途径已经阐明得比较清楚。花色苷的转录调控受正调控因子与负调控因子的影响，过去研究多集中于正调控因子的研究，而学界最近发现负调控因子对于保证植物正确响应发育及环境信号，进而精细调控花色苷的积累具有重要作用。在前期研究中，我们对荔枝花色苷的生物合成途径及其正调控的网络进行了深入的研究，但关于花色苷生物合成负调控方面的研究尚属空白。本项目将采用生物信息学、时空表达、亚细胞定位、酵母双杂、酵母三杂、VIGS、异源转基因等技术方法筛选荔枝果皮中花色苷生物合成的MYB类负调控因子，对其进行功能鉴定，阐明MYB负调控花色苷生物合成的分子机制，完善植物花色苷生物合成的调控机制，为荔枝果实色泽调控及外观品质的改良提供理论依据。

色泽是果实品质的重要组成部分，荔枝果皮的红色主要来源于花色苷的积累。在前期研究中，项目组对荔枝花色苷生物合成的正调控因子进行了系统研究，但其负调控因子的研究还未见报道。本项目对荔枝中花色苷生物合成MYB负调控因子进行筛选与功能验证，主要研究结果如下：（1）克隆到3个R2R3-MYB（LcMYBC2-L1、LcMYBC2-L2和LcMYB4）和1个R3-MYB（LcMYBx）类抑制子，转LcMYBC2-L1和LcMYBx基因烟草株系的花色偏白，花色苷含量显著降低，表明其参与花色苷生物合成的负调控；（2）LcMYBx仅含有R3结构域，没有抑制基序；LcMYBC2-L1含有R2和R3两个结构域，还有其他物种上报道的MYB抑制子中保守的C1和C2基序；两者都含有与bHLH互作的基序；（3）亚细胞定位表明LcMYBC2-L1和LcMYBx均定位在细胞核；酵母双杂和BiFC表明，LcMYBC2-L1和LcMYBx分别能够与LcbHLH1、LcbHLH3互作；（4）双荧光素酶报告系统表明LcMYBx显著降低了LcMYB1+LcbHLH3对LcDFR启动子的激活能力，LcMYBx通过与LcMYB1竞争性结合LcbHLH3从而抑制花色苷的生物合成；（5）双荧光素酶报告系统表明LcMYBC2-L1显著降低了LcMYB1+LcbHLH3对LcDFR、LcUFGT启动子的激活能力；当对LcMYBC2-L1与bHLH互作的区域、C1和C2基序分别进行点突变，突变体抑制LcMYB1+LcbHLH3对LcDFR、LcUFGT启动子激活能力均有不同程度的减弱，矮牵牛叶片瞬时表达也表明突变体抑制花色苷生物合成的能力减弱；酵母三杂表明LcMYBC2-L1和LcMYB1是协同与LcbHLH1/3互作的关系，LcMYBC2-L1通过C2基序来行使其主动抑制荔枝花色苷的生物合成。此外，本项目建立了发根农杆菌介导的荔枝遗传转化技术体系，阐明了光和ABA调控荔枝果皮花色苷生物合成的分子机制，挖掘到1个荔枝果皮花色苷生物合成的正调控因子LcMYB5并进行了功能验证。本项目发表论文8篇，其中SCI论文6篇，授权国家发明专利1项，培养博士生2名，硕士生4名。本项目按计划完成项目目标，阐明了MYB负调控荔枝花色苷生物合成的分子机制，为荔枝果实色泽调控及外观品质的改良提供理论依据，也为园艺植物颜色基因工程提供基因资源。