Ras GTPases调控耳蜗血-内淋巴屏障结构蛋白与p-糖蛋白的分子机制

感音神经性耳聋危害性大，但疗效欠佳。我们研究发现耳蜗血-内淋巴屏障损伤与各种神经性耳聋发生密切相关，前期工作显示线粒体损伤是血-内淋巴屏障的病理基础，但机制尚不清楚。我们还发现线粒体损伤致血管纹边缘细胞间结构蛋白（Z0-1）和p-糖蛋白（p-GP）功能发生明显改变，结合文献强烈提示线粒体损伤可能通过Ras GTPases信号通路影响血-内淋巴屏障功能。为此本项目采用细胞LRET及信号干预等方法，研究：①生理情况下Rac1对血管纹边缘细胞间Z0-1的作用及毛细血管内皮细胞p-GP对血-内淋巴屏障的维持作用；②病理情况下，RhoA诱导血管纹边缘细胞MLC磷酸化、Rac1诱导F-actin重排对Z0-1的作用，Rab5对内皮细胞p-GP功能的影响。阐明Ras GTPases信号通路对血-内淋巴屏障失稳态的作用及调控机制。为探索感音神经性耳聋发病机制提供理论依据，为寻找更有效的治疗手段提供新思路。

纳米产品是人类面临的新挑战，本课题经过调整后重点探讨与纳米颗粒投放相关的免疫调控及内耳生物屏障变化的分子机制。主要进展如下：线粒体毒素耳蜗急性试验提示与细胞活动相关的能量消耗（代谢越活跃的细胞对ATP不足越敏感）。尺度依赖的纳米脂质体跨大鼠中-内耳屏障转运及运输后的形态（纳米脂质体尺度越小，通过中-内耳屏障效率越高，在外淋巴液中形态完整）。用新颖的持续自动投放器在体给药后纳米脂质体到达内耳的通路（纳米脂质体从微渗透泵缓慢地被释放，形态不受Gd-DOTA影响。上鼓室投放纳米脂质体经卵圆窗进入内耳; 中鼓室投放纳米脂质体经圆窗入内耳）。鼓室投放后纳米脂质体在大鼠内耳的生物兼容性（不影响听力及耳生物屏障功能，不影响耳蜗糖胺多糖和透明质酸分泌及CD44和TLR2表达，不诱导细胞凋亡）。泛素编辑蛋白A20通过上调CD68表达和活化TLR4通路参与调节银纳米颗粒诱导的大鼠耳蜗炎症反应（鼓室注射银纳米颗粒（AgNPs）可逆地干扰耳生物屏障功能，高浓度AgNPs部分可逆地损伤听力。AgNPs上调CD68，激活TLR4，赋予耳蜗细胞巨噬细胞样功能，增强免疫活性。A20和RNF11调节炎性细胞因子表达维持耳蜗微环境）。鼓室投放MnCl2用MRI显示大鼠内耳Ca++代谢状态（MRI显示Mn++在内耳分布模式可用于监测内耳Ca++代谢活动）。经低频振动治疗后梅尼埃病患者内耳症状的改善（低频振动抑制眩晕并缩小双侧cVEMP振幅差异，改善耳鸣和耳闷，不影响听力）。低频振动在前庭损伤动物模型中诱导保护性应激相关蛋白激酶变化（振动促进三硝基丙酸（3NP）诱发平衡失调的恢复。纠正3NP处理降低的内耳蛋白激酶磷酸化和增加的前庭核蛋白激酶磷酸化水平）。低频旋转振动对正常志愿者听力的影响（对听觉系统是安全的）。其他研究包括，银纳米颗粒鼓室投放对大鼠耳蜗基质及生物屏障稳定相关分子的影响（耳蜗高表达MMP7，中表达MMP9，不表达MMP2，不受AgNPs影响；表达透明质酸合成酶3、透明质酸酶2和3，后续将行定量分析；高表达pClaudin-6，中表达CGRP，不受AgNPs影响；弱表达RohA和ROS，AgNPs使其升高）。银纳米颗粒鼓室投放上调大鼠耳蜗神经营养因子RET表达，不影响TrkB表达。极度氧化应激的人脂肪衍生的间充质干细胞具有高度生物活性，CD105表达升高，CD45、CD31和CD206表达降低