花生栽培种及野生种中抗病相关miRNA的鉴定和功能研究

作为我国重要的油料作物，花生的病害日趋严重，严重影响了其产量和品质。而野生花生具有抗病、抗虫等优良性状，这些性状可能与miRNA的调控有关。本研究从构建花生栽培种和野生抗病种（Arachis duranensis）在正常生长和青枯病菌诱导下的miRNA富集文库入手，利用高通量测序和生物信息学等技术手段，进行花生栽培种与野生种中miRNAs及其靶基因的鉴定，阐明miRNAs在栽培种和野生种中的种类、分布及表达的差异；根据在正常生长和病菌侵染下表达丰度的变化，鉴定青枯病菌诱导的miRNA及其靶基因。通过在花生或烟草中过量或者抑制表达miRNAs及其靶基因，验证这些抗病相关miRNAs的功能，揭示其在病菌诱导下调控的分子机理，拓宽对植物miRNA的认识和了解；从miRNA的角度探索野生花生抗病的分子机理。为利用miRNA提高花生抗病能力奠定基础。

花生是我国重要的油料作物和经济作物，目前我国食用油自给率严重不足，大力发展花生生产对于保障我国食用油安全具有积极的意义。在花生生产过程中，青枯病等病害日趋严重，成为了限制花生生产的重要因素。一些花生的近缘野生种内有丰富的抗逆基因，是花生抗病、抗虫、抗干旱种质创新的重要基因库，具有很高的利用潜力。特别是野生花生（Arachis glabrata）被认为是抗病性最强的野生花生，对花生叶斑病、叶锈病、病毒病、根线线虫病、青枯病等均有很好的抗性，是野生花生抗病机理研究和挖掘抗病基因的理想材料。miRNA是一类内源的非编码小分子RNA，越来越多的证据表明miRNA在植物与病原微生物互作的过程中起到重要的调控作用。为了揭示miRNA在花生抗青枯病中的作用，我们构建了对青枯病菌敏感的栽培花生鲁花14号和高抗青枯病的野生花生Arachis glabrata 在接菌和接菌后的4个sRNA文库和1个降解组文库。通过二代测序技术对sRNA和降解组文库进行了深度测序，明确了栽培花生和野生花生中sRNA的序列信息，阐明了sRNA的种类、数量和表达丰度等信息。通过生物信息学分析，总计获得了155个known miRNA，其中有73个是花生中新发现的，另外还鉴定了31个novel miRNA。根据测序和qRT-PCR验证的结果，总计获得了35个显著响应病原菌胁迫的miRNA，预测了这些miRNA的靶基因，并利用降解组测序和5’RACE明确了miRNA对靶基因的切割作用。我们发现，在花生中很多抗病相关的基因都是miRNA的靶基因，说明miRNA在花生抗病体系中具有重要的作用。进一步我们构建了miR156a、miR394a、miR408a-5p、miR397a、miR398a、miRn6，miRn12和miRn13总计8个miRNA的表达载体，并转化模式植物烟草。克隆了多个miRNA的靶基因，阐明了靶基因的表达模式，分析了miRNA的功能。本课题发表基金标注的期刊论文7篇，其中SCI论文4篇。获得山东省农业科学院科技进步一等奖1项，申请发明专利3项，授权3项，发表会议论文3篇，培养博士后1名，硕士研究生1名，完成了考核指标。