旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子在虫体侵袭与寄生过程中的功能探析

Serine protease inhibitors play a variety of important biological roles by controlling endogenous and exogenous proteolytic activities. During parasite infection, serine protease inhibitors are important factors in escaping host immune response and play important roles in suppressing the host defense function. It is greatly signification for preventing parasite diseases to study the immunomodulatory mechanism of serine protease inhibitors, such as inhibition of antigen processing, apoptosis and function of the serine protease derived from host immune cell. In this study, we analyze the interaction between Trichinella spiralis serine protease inhibitor (Ts-serpin) obtained previously by immune screening and the different serine protease derived from host immune cell by transcription-translation in vitro and radiolabeled method. Furthermore, we explore immune regulation roles of Ts-serpin in suppressing cytotoxic T-lymphocytes cells induced apoptosis and regulation of activity of dendritic cell and macrophage by molecular biology and immunological methods, which could provide reference for understanding interaction between Trichinella spiralis and host. Meanwhile, it will also provide a new theoretical basis for the immune escape mechanisms of Trichinella spiralis and other related parasites.

研究表明丝氨酸蛋白酶抑制因子通过控制内源性或外源性蛋白酶的蛋白水解活性，参与生物体内广泛而重要的生理活动。在寄生虫感染过程中，丝氨酸蛋白酶抑制因子是逃逸宿主免疫反应的重要因子，在抑制宿主的防御功能中发挥重要作用。因此研究其免疫调节机制如抑制抗原加工、细胞凋亡和免疫细胞分泌的丝氨酸蛋白酶的功能，将对寄生虫病的防治具有重要的意义。本研究拟采用体外表达及放射性标记等方法对我们之前免疫筛选得到的旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子(Ts-serpin)与宿主免疫细胞分泌的不同类型的丝氨酸蛋白酶的相互作用进行分析，并利用分子生物学和免疫学方法对其抑制细胞毒性T细胞诱导的细胞凋亡以及对树突状细胞和巨噬细胞功能的影响进行探究，从而为旋毛虫与宿主间的互作研究提供参考，同时为揭示旋毛虫及相关寄生虫的免疫逃逸机制提供新的理论依据。

本课题主要分析旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂对宿主不同来源的丝氨酸蛋白酶活性的抑制及相互作用，体外研究旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂对宿主免疫细胞功能的影响，并利用基因沉默（RNAi）技术，对其功能进行体内鉴定；同时对其反应原性和免疫原性进行评估，为旋毛虫重组蛋白疫苗的研究奠定基础。经过本课题的实施结果表明：1. 通过生物化学方法即底物特异性反应证明了原核表达并纯化的旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子(Ts-serpin)和伪旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子(Tp-serpin)对宿主免疫细胞分泌的不同类型的丝氨酸蛋白酶具有抑制作用；2.体外实验证明rTp-serpin可改变巨噬细胞的活性，并可能通过JAK2/STAT3信号通路诱导巨噬细胞转化为替代性活化表型；表明rTp-Serpin可能是一种具有潜在的抑制炎症反应的活性分子，有助于寄生虫的长期寄生；3.利用基因沉默(RNAi)技术，表明沉默Ts-serpin后，旋毛虫感染宿主的能力降低,确定Ts-serpin在旋毛虫寄生中发挥重要作用；4.利用重组蛋白rTs-serpin和rTp-serpin的免疫兔血清鉴定其在旋毛虫虫体的表达特性，表明Ts-serpin在旋毛虫不同发育时期（Ad5、NBL、ML）的虫体表面和内部均有表达；而Tp-serpin表达于伪旋毛虫不同发育时期的虫体表皮；表明这两种蛋白与虫体的早期发育相关，同时参与宿主与寄生虫相互作用；5.将重组蛋白rTs-serpin和rTp-serpin分别免疫小鼠，证明2个基因均可诱导产生体液和细胞免疫反应，同时产生混合型Th1/Th2免疫反应，并以Th2型为主；并对机体产生部分保护性免疫，旋毛虫肌幼虫减虫率分别为30.5%和24.42%，证明这两个基因均是抗旋毛虫疫苗的良好候选基因。通过该项目的资助，项目负责人经过三年的工作，共发表相关SCI论文5篇，部分研究工作获得中国博士后科学基金第52批面上资助和中国博士后科学基金第8批特别资助。