纤毛过表达在腺病毒感染及其在抗肿瘤治疗中的机理和应用研究

Adenoviruses are common causes of infections in respiratory or digestive system. Cells infected by adenoviruses are lysed, releasing high number of progeny viruses. It is assumed that adenovirus infection can result in exponential expansion of viral progenies. Oncolytic adenoviruses have been developed as a promising approach for cancer treatment.However,the success in pre-clinical studies has not been satisfactorily translated into clinical application. Our previous work has demonstrated that cancer cells infected by oncolytic adenoviruses, or various wild-type adenoviruses over-express and secret excessive amounts of free fiber molecules before progeny viruses are released. As such, adenoviral receptors on non-infected surrounding cells are "masked" by free fiber molecules, resulting lower infection efficiency of these cells by progeny adenoviruses. Fiber overexpression has been a known fact for adenoviral infection, but its biological consequence was poorly identified. In this project, we aim to investigate the molecular mechanisms of fiber over-expression and secretion. We will also investigate the function of fiber overexpression and secretion during adenoviral infection of polar epithelial cells, for understanding how adenoviruses can establish infection in respiratory or digestive system. Further, we will engineer oncolytic adenoviruses that cause diminished fiber expression and secretion in cancer cells, to investigate whether reduction of fiber expression and secretion can result in improved progeny spread and thereby increase cancer therapy effect by oncolytic adenoviruses.

由5型腺病毒改造而来的溶瘤腺病毒被广泛用于肿瘤基因治疗研究, 虽然在临床前研究中取得了巨大成功，但在临床实验中没有达到预期的疗效。我们应用病毒与宿主共存的新概念来系统地研究(溶瘤)腺病毒感染的机制并部分证明了该概念的重要性。以非极性的肿瘤细胞为宿主，我们的研究发现: 溶瘤腺病毒和多种野生型腺病毒的感染引起纤毛（Fiber）分子过表达和分泌，游离纤毛在子代病毒释放前结合并封闭邻近细胞表面的腺病毒受体，降低子代病毒的感染效率。本课题将深入研究腺病毒纤毛过表达和分泌的分子机理。 以此为基础，我们将一方面研究在腺病毒感染极性上皮细胞（如呼吸道、消化道）过程中，纤毛过表达是否调控子代病毒的扩散；另一方面研究和设计不能引起受体封闭，或受体封闭能力低的溶瘤腺病毒， 建立治疗肿瘤的新策略。

人类腺病毒（Adenovirus）是一种常见的病原体。目前由腺病毒改造而成的溶瘤腺病毒被广泛用于肿瘤的基因治疗研究。这一应用虽在临床前研究中取得了成功，但在临床治疗中并没有获得预期疗效。我们之前的研究发现：溶瘤腺病毒和多种野生型腺病毒感染细胞过程中，Fiber蛋白会过量合成并优先于子代病毒分泌到细胞外，与未感染细胞表面的受体结合，从而影响子代病毒的传播。但目前对于Fiber蛋白及Penton base蛋白的分泌机制及感染极性上皮细胞过程中Fiber发挥的作用仍不清楚。.本课题研究了以下问题：.（1）C型腺病毒（Ad2及Ad5）感染A549细胞早期，Fiber的分泌动力学及分泌途径。利用流式细胞仪检测到，Ad2及Ad5感染细胞后，其Fiber的分泌早于Penton base。而通过免疫透射电镜发现，Fiber与Penton base并没有在细胞膜以共定位的形式存在。在Fiber分泌过程中，解聚细胞骨架或抑制Rock蛋白激酶和myosinⅡ活性，都会干扰Fiber的分泌。不仅如此，当抑制细胞内的钙离子后，Fiber分泌过程也会被抑制。这一研究结果说明，腺病毒感染细胞后，Fiber的分泌被激活，且该过程不依赖于Penton base。同时，Fiber的分泌需要细胞骨架及细胞内钙离子的参与。.（2）5型腺病毒感染肠道极性上皮细胞（T84）过程中，分泌到细胞外的蛋白复合物成分及其对极性上皮细胞间细胞连接的影响。腺病毒感染A549细胞36小时后，对其细胞培养上清液进行超速离心，去除病毒颗粒后，将不含腺病毒的上清液孵育T84细胞。通过免疫荧光实验发现，形成紧密连接的CAR和形成桥粒的DSG2分子的定位发生改变。通过分子筛，将5型腺病毒感染细胞后的上清液进行分离纯化，并利用免疫蛋白印迹及液相色谱串联质谱对蛋白复合物成分进行鉴定。结果显示，5型腺病毒感染细胞后，会分泌两种Fiber蛋白复合物，即Fiber、Penton base、Hexon构成的复合物和Fiber、Hexon构成的复合物。含Penton base的复合物可以内化进入上皮细胞，并破坏上皮细胞间的细胞连接。而Fiber及Hexon构成的复合物则不能内化进入细胞，而是大量聚集在细胞膜，从而起到阻碍子代病毒感染的作用。这一研究结果说明，5型腺病毒分泌的两种Fiber蛋白复合物在其感染极性上皮细胞过程中发挥了不同的作用。