复制型HBV载体表达免疫抑制因子制备HBV慢性感染树鼩模型的研究

Up to now, there is no ideal chronic Hepatitis B virus (HBV) infection animal model available. Although it is confirmed that that tupaia is susceptibile to HBV infection, but HBV is quickly cleared by the immune system after a brief viremia. If HBV could infect the ongoing NTCP transgenic animal model, it will also face such obstacles. The outcome of HBV infection depends on the balance between antiviral immunity and virus immune suppression. The survival strategy for many viruses, including HBV, is dependent on its immune suppression function. The idea of this study is to enhance the immune suppression function of HBV in order to achieve a chronic infection. In the short-term financing of the National Natural Science Foundation of China, we have successfully prepared the replication-competent HBV vector, which makes it possible to endow HBV with additional immune suppression function. In this project, 3 replication-competent HBV vectors with theoretically immune suppression function (expressions of Epstein–Barr virus interleukin 10, Cytomegalovirus IL-10 and the N terminal peptide of Sendai virus C protein) will be constructed on the basis of our replication-competent HBV vector. In cell culture conditions, we will observe their molecular biological and immunological properties, for screening the best one with immunosuppressive activity in tupaia cells. Tupaia with be infected with viral particles derived from the recombinant HBV vectors. Characteristics of tupaia model of chronic HBV infection will be observed. The present study will provide an universal recombinant HBV that leads to chronic HBV infection, and provide a small animal model of chronic HBV infection, which will contribute to the development of anti-HBV drugs and vaccines.

目前仍缺乏理想的HBV慢性感染动物模型。虽已确认树鼩对HBV易感，但短暂病毒血症后迅速被免疫系统清除。即使未来NTCP转基因动物能感染，也将遇到类似问题。HBV感染的结局取决于抗病毒免疫与病毒免疫抑制之间的平衡，包括HBV在内的许多病毒的生存策略是依靠其免疫抑制功能，本课题设想额外强化HBV的免疫抑制功能，以实现慢性感染。本课题在国家自然科学基金短期资助下成功制备了复制型HBV载体，使得赋予HBV额外免疫抑制功能成为可能。本项目制备3种理论上具有免疫抑制功能的HBV载体（分别表达EB病毒和巨细胞病毒IL-10、仙台病毒C蛋白N端肽），在细胞培养条件下观察其分子生物学和免疫学特性，以筛选出对树鼩具有免疫抑制活性者；利用重组HBV颗粒感染树鼩，观察其慢性HBV感染情况。本研究将提供通用的导致慢性HBV感染的重组HBV，并提供一个慢性HBV感染的小动物模型，将有助于抗HBV药物及疫苗的研发。

在我国，一般人群HBsAg携带率为7.18%，目前缺乏缺乏理想的药物疗法。制备理想的慢性HBV感染的动物模型，将有助于HBV分子生物学的研究及药物的研发。在目前的HBV感染动物模型中，黑猩猩只能急性感染，树鼩只能一过性感染。病毒进入体内后，很快被免疫系统所清除，难以象在人体内那样形成慢性感染。本项目在HBV基因组上进行小改动，在赋予其免疫抑制功能的同时，仍保持复制与感染能力，由此构建慢性HBV感染的树鼩模型。本研究首先成功构建了具有复制与感染能力的HBV载体。尽管HBV基因相互重叠，我们采取了一个新策略，利用段小的内部核糖体进入位点（IRES），把HBV核心蛋白与P蛋白重叠区域分开表达，在C蛋白与P蛋白之间表达外源基因，发现HBV能够携带约400bp(±)的外源基因片段。插入外源基因后，研究证明了其不仅具有完全自主复制能力，同时也具有感染能力。在HBV前S1起始处，与基因A、B、C型相比，基因D型缺失了11个氨基酸，本研究利用基因D型HBV为载体，在前S1起始处插入一个仅13个氨基酸的仙台病毒C蛋白N端肽，以增强HBV免疫抑制功能。所产生的重组HBV，不仅自主复制能力没有改变，也没有改变其感染能力。本项目利用4种策略增强HBV免疫抑制能力，包括：在HBV前S1起始处插入一个仙台病毒C蛋白N端13肽；HBV核心蛋白与P蛋白之间表达CMV IL-10、EB病毒IL-10、仙台病毒C蛋白肽与SOG的融合蛋白。证明4种策略均有助于延长HBV感染时间，其中以在前S1起始处插入仙台病毒C蛋白N端13肽为最佳。为HBV研究提供了一个慢性感染模型。本项目对具有紧凑且重叠基因的HBV进行了成功的改造，保持了其复制与感染能力，有助于HBV分子生物学研究；通过动物实验研究，提供了一个慢性HBV感染的小动物模型，有助于抗HBV药物的研发。