利用基因重组HBV建立树鼩慢性HBV感染模型

Up to now, there is no ideal Hepatitis B virus (HBV) infection model available. Evidences indicated that tupaia is susceptibile to HBV infection, but HBV is rapidly cleared by the immune system after just transient Viremia. Based on the survival strategy from other virus, we want to induce tupaia chronic HBV infection through giving HBV immunosuppression function by constructing of a replication-competent HBV vector. First, we will construct a replication-competent HBV vector on the basis of wild-type HBV expression plasmid by gene engineering method. The overlapping region of HBV Core and Polymerase will be separated and then an exogenous gene will be inserted between them. Double small internal ribosome entry site (IRES) sequences will be employed for the translation of exogenous gene and the polymerase repectively. The molecular biological characteristics of the HBV vector will be analysed in detail. Second, HBV vectors with theoreticly immunosuppression function (expressions of Epstein-Barr (EB) virus interleukin 10 (IL-10), Cytomegalovirus (CMV) IL-10 and a fusion protein of the N terminal 1-23 peptide of Sendai virus C protein with a small fluorescent protein "miniSOG" respectively) will be constructed and selected for the performance in tupaia cells. Finally, the viral particle from the recombinant HBV vectors with immunosuppressive function is planed to be used for the infection of tupaia in vivo. Characteristics of tupaia model of chronic HBV infection will be observed. In addition to that the new HBV vector will have wide application in HBV molecular biology, this project is expected to provide the first chronic HBV infection model with high viral load.

目前仍缺乏理想的HBV感染模型，种种迹象表明树鼩对HBV易感，但短暂病毒血症后迅速被免疫清除。本研究拟借用其它病毒的生存策略，通过制备复制型HBV载体，赋予其免疫抑制功能，使树鼩形成慢性HBV感染。首先,在表达野生型HBV质粒基础上构建复制型HBV载体，利用基因工程方法把相互重叠的HBV C与P蛋白分开，在C、P蛋白间插入外源基因，利用2个小的强效IRES分别表达外源基因和P蛋白，揭示其分子生物学特性；其次，制备3种理论上具有免疫抑制功能的HBV载体（分别表达EB病毒IL-10、巨细胞病毒IL-10、仙台病毒C蛋白N端23肽与一种小荧光蛋白的融合蛋白），在细胞培养条件下筛选出对树鼩具有免疫抑制活性者；最后，利用具有免疫抑制功能的重组HBV颗粒感染树鼩，观察树鼩体内慢性HBV感染情况。本研究除新型HBV载体在HBV分子生物学方面具有广泛用途外，将有望提供首个高病毒载量慢性HBV自然感染模型。

病毒载体是通过基因工程手段对病毒进行改造，通过亲本病毒的原始感染途径，携带非病毒遗传信息进入细胞。目前已成功构建了多个能携带报告基因同时也具有复制能力的病毒载体，能够简化并定量检测病毒复制和感染，在识别抗病毒药物和病毒易感细胞等方面发挥了重要作用。HBV是一个基因组很小的DNA病毒，由于在其3.2kb小基因组中插入任何外源基因，都难以避免对其基本复制元件的影响，因而目前尚没有制备出复制型HBV载体。前基因组RNA(pgRNA)是HBV逆转录复制的模板，同时也用于核心蛋白和多聚酶蛋白翻译，且二者在基因序列上有约150bp重叠区。下游的多聚酶蛋白的翻译也不是通过常规的内部核糖体进入位点(IRES)。我们设想把核心蛋白与多聚酶重叠区域分开表达，中间插入两个IRES分别用于表达外源基因和多聚酶，产生一个有功能的且不影响囊膜蛋白表达的三顺反子pgRNA。为尽量减少对HBV基因组长度的影响，本研究采用一个仅22nt的小Rbm3 IRES，通过报告基因模型证明了其在双顺反子及三顺反子的活性；在表达HBV全基因组的HBV表达质粒上，分别构建了携带399bp的杀稻瘟菌素抗性基因（BsdR）和720bp的人源化绿色荧光蛋白（hrGFP）的HBV载体，证明了其产生核心蛋白及囊膜蛋白的能力与野生型HBV类似。尽管表达hrGFP的HBV载体复制水平较低，表达BsdR的HBV载体的DNA复制水平能够达到野生型HBV的40%。这两个载体均能够产生有囊膜的HBV颗粒，并且可感染HBV易感细胞系HepaRG。鉴于许多报告或效应基因在500bp左右，本研究所制备的新型HBV载体将成为HBV分子生物学研究的有力工具。