负载供体抗原的ecpDC诱导小鼠小肠移植特异性免疫耐受的机制研究

Intestine transplantation is the most effective treatment for the short bowel syndrome and intestinal failure. However, intestine presents much greater immunologic challenge than other solid organs. EcpDCs are immature dendritic cells that uptake lymphocytes treated with 8-methoxypsoralen and ultraviolet A light. Our previous research has shown that infusion of ecpDCs inhibited rat cardiac allograft rejection , induced CD4+CD25highFoxp3+ regulatory T cells and down-regulated T cell immune reactivity. Moreover, we have improved the induction protocol of EcpDCs and successfully generated donor antigen specific EcpDCs by using soluable donor antigen. In this project, we intend to adoptivly transfer ecpDC-dsa to the recipient mouse of small bowel transplant, and assess its effect in inducing donor specific immune tolerance. we will analyze the effect of ecpDC-dsa to the mouse small bowel allograft pathology, donor-antigen specific humoral and cellular immune response , C4d deposition in allograft tissue and the expression of TGF β-l, IL-10, FOXP3 in allograft tissue, to clarify the effect and mechanisms of ecpDC-dsa to allograft rejection response in mice. Moreover, we will analyze the effect of ecpDC to the CD4+T cell proliferation, apoptosis, cytokine production influence as well as inducing T cell anergy and regulatory T cells production, to expound the underlying mechanisms for negative immune regulation of the ecpDC-dsa, to aplly photopheresis for the treatment in clinial small bowel transplantation rejection.

短肠综合征及肠衰竭是影响人类健康的重大疾病，小肠移植是其最有效的治疗手段，但排斥反应却较其它脏器移植突出，严重影响移植物存活。我们采用体外光化学疗法，制备了吞噬调亡淋巴细胞的未成熟树突状细胞（ecpDC），并在大鼠心脏移植模型证实其具有负向免疫调节功能。我们还构建了负载供者抗原的ecpDC-dsa。在此基础上，本项目拟采用已建立的小鼠小肠移植模型，回输ecpDC-dsa至受者，诱导供者特异性免疫耐受。观察供者抗原特异性体液/细胞免疫反应、移植物组织病理、移植物C4d沉积及TGFβl、IL-10、FOXP3的表达情况，探究ecpDC-dsa对排斥反应的负向免疫调控机制。同时，行体外实验分析ecpDC-dsa对各淋巴细胞亚群存活和增殖的影响，分析其诱导调节性T细胞产生和效应性T细胞失能的作用，揭示ecpDC-dsa的抗原特异性免疫调节机制，为临床防治小肠移植排斥反应和诱导免疫耐受奠定基础。

本课题组前期制备了一种未成熟的树突状细胞(immature DC，imDC)，在吞噬了异基因供体大鼠凋亡淋巴细胞后仍然维持不成熟状态，由于采用了光化学照射的方法处理异基因供体大鼠淋巴细胞促使其发生凋亡，故将这种imDC命名为ecpDC。给移植受者输注这种ecpDC能诱导受者T细胞的免疫低反应性，使受者Treg比例明显增加，移植物存活时间明显延长，提示其具有负向免疫调节作用。B细胞除了能通过产生抗体在体液免疫中发挥中心作用以外，还具有免疫调节作用。已有的研究表明， DC 可以作用于 B细胞，诱导效应性 DC 的分化。如，DC 细胞衍生的 IL-12 可以诱导幼稚滤泡状 B 细胞分化为产 IFN-γ 和 IL-12 的效应性 B 细胞，产 IFN-γ 和 IL-12 的效应性 B 细胞可以递呈抗原给幼稚 T 细胞，诱导 Th1 型免疫应答 。为了探讨ecpDC诱导 B 淋巴细胞成为高分泌白细胞介素( IL) -10 ( IL-10 + )的调节性B 细胞的可行性，我们将ecpDCs与 B 细胞共培养，筛选其分泌细胞因子的变化，结果发现，ecpDCs不能诱导 B 细胞产生IL-12、IFN-γ、PGE2、TGF-β 等细胞因子，但可以诱导B细胞高分泌IL-10。这一结果表明ecpDCs作为一类新型的调节性 DC，与常规 DC 相反，并不诱导 B 细胞向效应性 B 细胞分化，而是诱导 B 细胞向高分泌 IL-10 的调节性 B 细胞分化。进一步研究表明，输注ecpDC后，移植受者体内IL-10的表达水平增加，并诱导产生较多分泌IL-10的调节性B细胞，移植物存活时间明显延长；诱导调节性 B 细胞分泌 IL-10 需要可溶性因子的参与。我们根据前期实验结果，筛选了ecpDCs 分泌的细胞因子谱，预先用中和性抗体中和这些细胞因子的效应，然后再加入脾脏 B 细胞，共培养 48 小时后，检测共培养上清中的 IL-10 分泌水平。结果表明， ecpDCs诱导调节 B 细胞高分泌 IL-10 部分是由 ecpDCs 所产生的 IFN-β所介导的。.总之，PUVA-SP DC 作为一种DCreg，可诱导IL-10 + 调节性B 细胞的产生，从而进一步扩大了其独特的免疫负向调控功能。本研究结果将有助于更好地理解调节性ecpDC 参与免疫调控的机制，为临床免疫治疗的设计提供了理论基础。