滤泡辅助T细胞在肾移植供者特异性抗体介导排斥反应中的作用机制

Potent and specific immunosuppressive agent significantly improved 1-year graft kidney survival. However, the long-term (10-year) survival rates have stagnated over the past decade. Antibody-mediated rejection (AMR) is considered the most important barriers that limit long-term outcomes. Recent studies indicate that donor-specific antibodies (DSA) play a critical role in mediating AMR，while its generation mechanism remains less defined. The follicular helper T cells (Tfh) are the key helper cells in the differentiation of B-cells into immunoglobulin-producing plasmablasts, which generate antibodies. It is unclear to what extent the Tfh cells regulates AMR in kidney-transplant background. According to the literature and the results of our recent studies, we hypothesize that in the Tfh cell may tend to assist activated B cells differentiate into memory B cell during the pre-sensitized stage. While the post-transplant immune microenvironment may affect the growth and differentiation of Tfh cells, thus affect the generation of DSA and the initiation of AMR. On this basis, this project intends to use Ascl2, Bcl6 and ICOS genetically engineered mouse constructed mice kidney transplant AMR model, together with clinical specimens in renal transplant recipients. Using qRT-PCR, flow cytometry, confocal microscopy and real-time in vivo microscopic imaging techniques, to perform in vivo study of the activation, differentiation, and function of Tfh cells in kidney transplantation background. To investigate the relationship between Tfh cells function and recipient immune status. The current project should be useful for future clinical anti-AMR treatment.

抗体介导的排斥反应（AMR）是影响移植肾长期存活的最关键原因，目前仍无有效的临床防治措施。供者特异性抗体（DSA）是介导AMR的最主要抗体，滤泡辅助T细胞(Tfh)在抗体产生过程中发挥关键作用，但缺乏移植背景的研究，课题组在前期发现Tfh细胞参与移植肾AMR的淋巴组织增生，但Tfh细胞在移植免疫背景下的分化发育和效应机制仍不明确。根据文献分析和课题组近期研究结果，我们推测移植后的免疫微环境可影响Tfh细胞的分化发育和效应。本课题拟采用Ascl2、Bcl6、ICOS等基因工程小鼠构建肾移植AMR模型，通过qRT-PCR、流式细胞分析、共聚焦显微镜、实时在体显微成像等技术，结合临床肾移植受者标本，研究移植背景下体内Tfh细胞活化、分化、发育和效应过程中的免疫学特性变化，分析与受者免疫状态及AMR启动程度间的关系，探究其在肾移植DSA所致AMR中的作用及其机制，为临床防治AMR提供新的理论依据。

抗体介导的排斥反应（AMR）是影响移植肾长期存活的关键因素，目前还没有有效的临床防治措施。滤泡辅助T细胞(Tfh细胞)在B细胞增殖、分化和抗体生成中发挥重要作用。课题组收集了健康志愿者和肾移植患者的临床样本（包括外周血和移植肾标本），发现AMR患者外周血中滤泡调节性T细胞（Tfr细胞）比例显著低于Non-AMR患者，产生IL-21的Tfh细胞亚型（Tfh2和Tfh17）的比例显著高于Non-AMR患者。免疫荧光染色结果显示AMR患者移植肾组织中Tfh细胞比例与Non-AMR患者没有显著区别，然而Tfr细胞比例显著低于Non-AMR患者。我们进一步分选出Tfh细胞、B细胞、Tfr细胞和树突细胞，发现Tfh细胞介导了淋巴细胞混合培养下，B细胞增殖、分化和抗体生成。Tfr细胞的比例增加能够显著抑制B细胞的增殖和分化，这个过程是通过分泌抑制性分子和CTLA-4接触性抑制来介导的。AMR、Non-AMR和对照组患者Tfr细胞具有同等的抑制B细胞增殖和分化的作用，IL-10和TGF-β分泌，以及CTLA-4的表达在三组间均没有显著的差异。淋巴细胞混合培养后，采用临床常用的免疫抑制药物刺激淋巴细胞，结果发现他克莫司和环孢素能降低产生IL-21的Tfh细胞亚型的比例，对AMR具有一定的治疗作用，而西罗莫司则没有显著的影响。我们深入分析了肾移植中Tfh细胞的作用机制，发现AMR与Non-AMR组之间Tfh细胞源性外泌体的比例无显著差异。AMR组中产生IL-21的Tfh细胞（Tfh2和Tfh17细胞）源性外泌体的比例显著高于非AMR组。基于外泌体构建靶向递送系统可显著诱导同种异体移植物的免疫耐受，降低组织中淋巴细胞的浸润。通过本课题，证实了Tfh细胞及其亚型在AMR中的作用及机制，为指导肾移植临床用药、AMR预防和治疗提供了参考。