高密度二氧化碳致死Escherichia coli的相关蛋白质确证及其结构变化研究

高密度二氧化碳（DPCD）杀菌技术是一种新型的食品非热力杀菌技术，与热杀菌相比，它能更好地保持食品固有的营养成分、色泽和新鲜度，研究日益增多。研究发现，DPCD杀菌过程中常伴有大量的蛋白质变性和酶失活现象，但又不是所有的蛋白质和酶都发生了变性和失活。为此，到底哪些蛋白质变性和酶失活与DPCD杀菌有关，以及DPCD如何导致其变性和失活的？目前还不清楚。本项目拟采用逆向思维的方式，以实验室获得的1株耐DPCD的E.coli突变株为对象，采用高通量测序、双向电泳和基因敲除等方法筛选获得E.coli突变株与野生株间的差异表达基因及其编码的蛋白质和酶，以突变株存活的原因反证并确证DPCD致死E.coli野生株的相关蛋白质和酶；同时以E.coli野生株为模板，经基因克隆、过量表达、分离、纯化获得与细胞死亡相关的蛋白质和酶，研究其在DPCD中的结构变化，揭示DPCD致使其变性和失活的分子机理。

本项目采用转录组学、蛋白质组学技术筛选高密度二氧化碳（Dense Phase Carbon Dioxide, DPCD）致死大肠杆菌过程中发挥关键作用的蛋白质，探究DPCD的杀菌机制。结果如下：（1）分析突变菌株与原始菌株在DPCD处理（37 ℃、8 MPa、30 min）前后脂肪酸组成的变化，突变菌株中棕榈一烯酸、十七烷酸、油酸、亚麻酸和总脂肪酸的含量显著增加，其中十七烷酸含量的增加与大肠杆菌的酸耐受性提高有关。（2）分析细胞内全蛋白与外膜蛋白组分的变化，发现突变菌株全蛋白及外膜蛋白均存在差异。采用蛋白质组学技术分析突变菌株与原始菌株在DPCD胁迫前后的蛋白质组变化。突变菌株与原始菌株的全蛋白质经双向电泳分离得到6个差异在3.5倍以上的蛋白质点，其中DNA结合蛋白H-NS、锰超氧化物歧化酶（MnSOD）、外膜蛋白F（OmpF）表达上调与突变菌株的DPCD耐受性提高有关。通过iTRAQ定量标记技术，鉴定到差异表达蛋白质420个，显著富集在核糖体、三羧酸循环、双组分系统、氧化磷酸化以及核苷酸剪切修复等38条信号通路。分析表明外膜蛋白Slp、γ-氨基丁酸逆向转运蛋白（gadC）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）以及核糖体、氧化磷酸化、DNA损伤修复与热应激等通路涉及的差异表达蛋白质对保护细胞抵御DPCD胁迫具有重要作用。（3）采用高通量转录组测序，分析突变菌株与原始菌株在DPCD处理前后基因表达水平的差异。突变菌株与原始菌株相比，共检测到显著差异表达的基因141个，显著富集在鞭毛装配、细菌趋化性、组氨酸代谢、双组分系统以及丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢5条信号通路。分析发现，编码小分子热休克蛋白的基因ibpA、编码酸休克蛋白的基因asr以及与组氨酸代谢相关的基因都与细菌的DPCD耐受性相关。（4）对突变菌株进行全基因组重测序，确定突变菌株存在3处插入位点、10处单核苷酸多态性位点变异。其中，1处插入位点、7处单核苷酸多态性位点位于外显子编码区域，涉及的基因分别为：ylbE（编码一种假定蛋白）、fhuA（编码外膜铁色素受体蛋白）、ybhJ（编码一种假定水合酶）、mntP（编码锰离子外排泵蛋白）、rpsD（编码核糖体亚基蛋白S4）、rpsL（编码核糖体亚基蛋白S12）。分析推测fhuA、mntP、rpsD、rpsL基因可能与突变菌株的DPCD抗性相关。