基于蛋白冠调控实现肿瘤靶向的阳离子基因传递系统研究

Cationic gene vectors are not stable in the body and their delivery efficiency is limited, which is an important scientific problem to be solved in the field of gene therapy. After intravenous injection of nanoparticles, the protein in the blood will form a layer of protein corona on their surface, which becomes the key interface of their interaction with the organism and affects the in vivo behavior of nanoparticles. In this study, the hyaluronic acid is modified by a polypeptide that specifically binds to the endogenous albumin, and then the modified hyaluronic acid is bound to the surface of the gene loaded cationic nanoparticles by electrostatic interaction to construct a nanoparticulate drug delivery system which could modulate the formation and dissociation of protein corona. The delivery system could modulate the formation of protein corona via specifically binding albumin and thus extend the blood circulation time of the nanoparticles and increase their distribution in the tumor. After reaching the tumor site, the nanoparticles could dissociate the protein corona in the acidic tumor microenvironment and expose the hyaluronic acid. Subsequently, the nanoparticles could enter the tumor cells via the CD44 receptor and exert the pharmacological effects. In the study, the melanoma with high expression of CD44 receptor was selected as the disease model and the miR-34a was used as the model drug to elucidate how the delivery system modulated the formation and dissociation of protein corona, providing theoretical and experimental basis for the clinical application of nanocarrier.

阳离子基因载体在体内的稳定性差且递送效率低，是基因治疗领域亟待解决的重要科学问题。纳米粒静脉注射后，血液中的蛋白质会在其表面形成蛋白冠状物，成为其与生物体作用的关键界面，进而影响纳米粒的体内行为。本课题创新性地利用一种能特异结合体内白蛋白的多肽对透明质酸进行修饰，然后将经修饰的透明质酸通过静电作用结合到载基因阳离子纳米粒表面，构建一种可调控蛋白冠的生成和解离的纳米递药系统。该递药系统不仅可通过特异性结合白蛋白来调控蛋白冠生成进而延长血液循环时间，提高其在肿瘤的分布，而且可以在肿瘤的酸性微环境作用下使表面的蛋白冠解离，暴露出透明质酸，进而通过CD44受体介导进入肿瘤细胞发挥疗效。本课题将以CD44受体高表达的黑色素瘤为疾病模型，miR-34a为模型药物，阐明该递药系统调控蛋白冠生成和解离的机制，为纳米载体的临床应用提供理论基础和实验依据。

纳米颗粒静脉注射后，血液中的蛋白质会在其表面形成蛋白冠状物，成为其与生物体作用的关键界面，进而影响纳米颗粒的体内行为。由血浆蛋白的去调理化作用得到启示，本课题设想通过对纳米颗粒表面的蛋白冠进行调控，使得纳米颗粒表面可以特异吸附去调理素蛋白，而排斥调理素蛋白，从而提高其体内的稳定性和递送效率。. 本课题首先使用能特异性结合体内白蛋白的ABD多肽（albumin-binding domain peptide）修饰脂质体，得到ABD肽修饰的脂质体ABD-PEG-Lip。研究显示，ABD-PEG-Lip与大鼠血清孵育后，其粒径增加，且形成的蛋白冠中白蛋白量显著高于普通脂质体PEG-Lip。此外，ABD-PEG-Lip的血液循环时间明显长于PEG-Lip，且其在肿瘤的分布也显著高于PEG-Lip。本课题还考察了能与体内白蛋白发生特异化学反应的马来酰亚胺基团（Maleimide）修饰的脂质体（Mal-Lip）的体内外行为。Mal-Lip的粒径为100 nm左右，且可在4 ℃稳定保存1周。将Mal-Lip与半胱氨酸溶液、白蛋白溶液和小鼠血浆进行孵育，它可显著降低样品中的游离巯基的数量，说明 Mal-Lip表面的马来酰亚胺基团可以与游离的巯基快速高效地反应。荧光能量共振转移实验结果表明白蛋白可以与Mal-Lip紧密结合。我们还采用葡聚糖凝胶电泳和Bradford法分析了Lip和Mal-Lip表面结合的白蛋白量，结果显示Mal-Lip结合的白蛋白量显著高于Lip。细胞毒性结果Mal-Lip在测试的脂质浓度范围内未显示出细胞毒性，表明马来酰亚胺基团的修饰并未增加脂质体的细胞毒性。细胞摄取试验结果显示在有血清和无血清的条件下，4T1细胞和Raw264.7细胞对Mal-Lip的摄取量都高于Lip。药动学研究和体内分布研究结果显示，Mal-Lip的血液循环时间比Lip要短，在肿瘤，肺脏和脾脏的蓄积量要高于Lip。.上述研究表明，通过对纳米颗粒表面进行功能化以调控其与血浆蛋白结合所生成的蛋白冠，可以对其体内行为进行调控。本项目所探索的通过调控蛋白冠生成的策略，可在理论上丰富提高纳米颗粒传递效率方面的研究内容，所构建的纳米载药系统具有调控蛋白冠生成的新特性，可望为纳米颗粒的改造提供新的思路。